動物脾臟發育研究進展

汪富文,羅小雨,王朝飛,楊 鴿,雷初朝,黨瑞華

(西北農林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

脾臟由結締組織和淋巴組織組成，是一個復雜外周淋巴器官，具有高度組織化的區域和復雜的微循環系統。脾臟在動物機體中承擔著存儲免疫細胞、濾血和儲血的重要作用，全面了解脾臟的解剖學、生理學和發育，對于確定支持脾臟疾病和先天性變異的病理生理機制至關重要。隨著現代生命科學的發展，對于脾臟的研究越來越深入，研究者發現不同物種脾臟的大小、形狀和組織結構有著明顯的差異。當前對脾臟的研究主要集中在人類和模式動物上，家畜和其他哺乳動物上尚沒有特別深入，物種間脾臟的差異程度和具體功能仍然存在爭議，深入探究家畜脾臟的功能和生長發育的具體機制能夠有力地推動家畜抗病性狀的遺傳選育。本文系統總結了目前關于脾臟發育的知識及當前研究中和脾臟發育有著密切聯系的基因，以期對哺乳動物脾臟的研究及家畜抗病育種提供一些參考資料。

1 脾臟的組織學結構

脾臟主要由白髓(white pulp, WP)、紅髓(red pulp, RP)和邊緣區(marginal zone，MZ)3個部分組成[1]。這3個部分的結構和細胞組成都有較大的差異，在動物免疫應答過程中發揮著不同的作用。白髓約占脾臟體積的25%，其中密集地分布著各類淋巴細胞，白髓小室由含有較多T細胞的淋巴鞘和富含B細胞的濾泡組成。淋巴鞘在中央小動脈周圍分布較多而B細胞濾泡主要分布在血管分支處[2]。脾臟的紅髓由靜脈竇、髓索和動脈系統的終末支組成。髓索是一個巨噬細胞網狀結構，具有相互連接的細胞質突起。髓索和靜脈竇緊密相連，靜脈竇的結構很特殊，由內皮細胞通過應力纖維連接到細胞外基質形成。這些應力纖維之間會形成縫隙，紅細胞必須通過這些縫隙才能重新進入循環，這一獨特的結構能夠阻止老化或受損的紅細胞通過，以便進一步處理這些衰老損傷的紅細胞[3]。此外，這一機制也能適當控制血液的流速。脾臟的先天免疫反應主要發生在邊緣區，包括兩組特殊的巨噬細胞：邊緣區巨噬細胞形成外環，金屬嗜酸性巨噬細胞形成靠近白髓的內環。邊緣區的巨噬細胞表達C型凝集素(DC-SIGN/SIGNR1)和清道夫受體(scavenger receptor)MARCO，這些物質能與某些病原體如結核分枝桿菌和肺炎鏈球菌的多糖抗原結合，并使其消化降解[4-6]。

2 脾臟的主要功能

2.1 免疫功能

依賴于豐富的免疫細胞類型，脾臟既能完成吞噬細胞為主的非特異性免疫功能，又可以通過T細胞介導的細胞免疫和B細胞介導的體液免疫完成機體的特異性免疫功能。脾臟還能夠產生T細胞和B細胞，在二次免疫應答過程中發揮重要作用。紅髓具有多種先天免疫細胞，可以作為免疫效應器進行免疫識別和應答，但紅髓最主要的功能還是對血液進行過濾，將有害物質和衰老、損傷的紅細胞清除[7]。白髓區域是脾臟免疫功能的主要承擔者，淋巴鞘和濾泡在免疫反應中共同作為免疫應答的生發中心[8]。淋巴鞘分布有大量的T細胞，可以形成淋巴細胞并且產生漿細胞。濾泡含有較多的B細胞和其他參與免疫過程的細胞，參與抗原的呈遞和免疫應答的發生[9]。

2.2 屏障功能

1986年，Weiss等[10]最先報道了與血-睪屏障類似的過濾機制，即血-脾屏障(blood-spleen barrier, BSB)，這一屏障對脾臟免疫功能的有序進行起到了重要的支撐作用。血-脾屏障的結構基礎是脾臟紅髓特殊的網狀結構，其主要的功能主要包括3部分：第一，阻止血液中病原體等有害物質的進入，同時攔截衰老損傷的紅細胞，適當控制血液的流速；第二，向白髓區域呈遞抗原，促使免疫應答的發生；第三，維持白髓內部環境的相對穩定，調節白髓的免疫功能[8]。

3 哺乳動物脾臟發育生理研究進展

脾臟發生的標志是背側中紋內間充質的凝結[11]，在小鼠中，脾臟大約在E10.5～11才能被檢測到，因為該階段祖細胞開始在背側濃縮集聚，位置靠近胃和背側胰腺。鑒于在早期發育過程中脾臟和背側胰腺間充質緊密相接，因此在E12.5～13之前很難從形態學上區分這兩種組織，往往只有使用脾臟和胰腺的標記物才能準確地去描述[12]。使用早期脾臟間充質細胞標記物對小鼠進行原位雜交分析，發現了一些標記基因，如Tlx1 (T-cell leukemia homeobox 1)、Nkx3-2 (NK3 homeobox 2)、Wt1 (WT1 transcription factor)、Tcf21 (transcription factor 21)、Nkx2-5 (NK2 homeobox 5)、Pbx1 (PBX homeobox 1)和Sox11 (SRY-box transcription factor 11)[13-18]，這些標記基因能夠清楚地顯示脾臟早期發育的具體特征。脾臟起源于胚胎內臟的中胚層，作為體內最大的外周淋巴器官，當脾臟組織發育完成時，其結構和功能就會進一步復雜化[19]。

脾臟作為重要的免疫器官，與家畜的抗病性狀有著密切的聯系，因此其發育生理及發育的具體機制也是動物育種的重要研究內容。崇慶慶[20]將云南高峰牛和荷斯坦牛脾臟組織全基因組DNA甲基化作比較分析，篩選出9 474個差異甲基化區域，注釋到2 718個差異甲基化相關基因，為兩種牛的表型及抗病力差異研究奠定基礎。劉銀雪等[21]對非洲白犀牛的脾臟進行形態學觀察，確定了犀牛和其他動物之間的脾臟形態差異，并就其成因作了推測。譚雪芬等[22]在牦牛脾臟上也進行了類似的形態學研究。關飛等[23]采集牦牛和普通黃牛的脾臟，從解剖學和組織學角度充分展示了牦牛和黃牛的脾臟生理學差異。在羊上，相關研究主要集中在羊脾臟基因和非編碼RNA的表達上，對于羊脾臟的發育及組織形態學研究還比較少。周熳琳等[24]探究了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在1歲藏羊脾臟的表達情況，發現VEGF廣泛分布于藏羊脾臟組織中，可能對藏羊脾臟形態結構和功能的維持具有重要作用。兩例F17大腸桿菌感染的湖羊脾臟轉錄組研究充分展示了感染前后脾臟中lncRNA和circRNA的差異表達情況，對于家養動物的脾臟非編碼RNA研究具有重要的意義[25-26]。車天棟[27]以家豬5個不同生長發育時間點和3頭成年野豬及其他9種哺乳動物的脾臟組織為研究對象，利用轉錄組測序技術將39個樣本在轉錄水平上進行研究，鑒定出大量差異表達的lncRNA，解釋了在不同生長發育階段豬脾臟的轉錄組水平差異。豬作為重要的模式動物之一，在轉錄組水平上研究其脾臟發育的過程也有助于我們更全面地了解哺乳動物脾臟發育的分子機制。不同物種或者同一物種不同品種脾臟轉錄水平研究主要反映其脾臟的功能差異[28]，能夠推動家畜抗病新品種選育及抗病性狀篩選的進程。

4 脾臟發育關鍵基因研究進展

通過基因敲除小鼠模型已發現了一些重要的脾臟發育基因，這些基因主要是編碼轉錄因子，控制脾臟的功能、形態發生和發育擴張。敲除Tlx1的小鼠為脾臟發育的遺傳控制提供首個重要的范例[29]。由于間充質細胞增殖減少[30]，Tlx1突變體胚胎的脾臟原基正常發育到E13.5時期后就停止了繼續發育，而Wt1缺失的胚胎中脾臟間充質細胞凋亡會導致脾臟幾乎完全缺失[31]。除此以外，NKX2-3、NKX3-2和Pbx1[30-33]的表達也是脾臟發育所必需的，在動物脾臟發育過程中不可或缺。

4.1 NKX2-3和NKX3-2基因

NKX2-3基因編碼含有同源域的轉錄因子，其編碼的蛋白質是同源域轉錄因子 NKX家族的成員。在小鼠中靶向破壞轉錄因子NKX2-3基因會導致腸道和脾臟發育異常。NKX2-3基因缺失小鼠要么是無脾的，要么是脾臟明顯縮小[34]，純合NKX2-3突變體會缺乏粘膜定位素細胞粘附分子-1(MAdCAM-1)，該分子通常在黏膜相關淋巴組織和脾臟中表達。NKX2-3是脾臟和粘膜相關淋巴組織中MAdCAM-1表達和淋巴細胞遷移所必需的[35]，并干預B淋巴細胞發育和分化[36]，脾臟血管系統的器官特異性模式由NKX2-3調節，其掌控著淋巴細胞歸巢機制和脾臟組織特異性的血液過濾能力[37]。除了對細胞和相關分子表達的影響，NKX2-3還會調控白髓的成纖維細胞亞群形成，進而影響脾臟結構發育[38]。

NKX3-2和NKX2-3同屬同源域轉錄因子NKX家族的成員。脾臟和胰腺的側向性依賴于一個特化的柱狀中胚層細胞層——內臟中胚層板，這層細胞能夠使得脾-胰腺區域向左生長，而NKX3-2能調節胰腺側移所需的內臟中胚層的功能[18]。該基因除了調控脾臟的發育，還同時影響著骨骼的生長[39]。

4.2 Pbx1基因

Pbx1基因編碼屬于轉錄因子PBX同源盒家族的核蛋白，已有研究證明Pbx1在多條途徑上都對脾臟發育進行調控，在脾臟發生中起著核心的分級協同調節作用[30]。Pbx1敲除的小鼠表現為脾發育不全，大多數器官系統發育不正常，且在骨骼上也有缺陷，通常在E15.5/16.5就會死亡[40]。Pbx1的缺失導致脾間充質祖細胞的NKX2-5表達下調，CDKN2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B)基因表達下調，從而擾亂細胞周期。去除Pbx1突變體中的CDKN2B基因可以在一定程度上挽救脾生長，因此，PBX/NKX2-5/p15調節模塊對脾臟發育至關重要，Pbx1作用的發揮必然是系統的，需要多個基因之間共同協作[41]。

4.3 Tlx1基因

該基因編碼一種核轉錄因子，屬于同源框基因的NKL亞家族。在胚胎發育過程中，編碼的蛋白質是脾臟正常發育所必需的，缺失該基因的小鼠僅表現出脾臟發育不全的表型特征[15]。Tlx1依賴的維甲酸(retinoic acid, RA)代謝調節對脾臟器官發生至關重要。在小鼠模型中，在脾臟原基形成過程中Tlx1的缺失會調節幾個與RA代謝有關的基因從而增強RA信號，RA活性改變會導致間充質細胞提前分化，脾原基血管生成減少，對Tlx1基因缺陷動物模型的RA信號的藥物抑制可一定程度上緩解脾發育缺陷的情況[42]。出生后骨髓外造血(extramedullary hematopoiesis, EMH)是造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)在骨髓外發生分化，以應對造血緊急情況的病理過程，Tlx1過表達可誘導EMH發生，并引起脾臟微環境的改變[43]。

4.4 Wt1基因

該基因編碼一個轉錄因子，在C端有4個鋅指基序，在N端有一個富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA結合域。Wt1的敲除小鼠表現為脾臟發育不全，且不能夠形成腎、心、膈肌和性腺等組織器官，一般在E15就會死亡[31]；幼年和成年小鼠敲除Wt1基因后短時間內，小鼠就會出現腎小球硬化、胰腺和脾臟外分泌萎縮、骨骼和脂肪嚴重減少、紅細胞生成受阻等特征[44]。Wt1基因參與脾臟紅髓索內的脾臟紅髓巨噬細胞暴露在血流中清除衰老的紅細胞的調節過程[45]。Wt1受到MIR-125a的調控，MIR-125a基因敲除小鼠會發展為骨髓、脾臟和外周血髓系細胞擴張的骨髓增殖性疾病，并同時伴有泌尿生殖系統異常[46]。Wt1的表達還受到Barx1 (BARX homeobox 1)基因的調節，Barx1的缺失會導致胃和脾臟的發育缺陷，但是從機制上來說并沒有影響其他脾臟發育基因的表達，只特異性下調了Wt1表達量，進而導致脾臟發育的異常[46]。

5 展 望

脾臟是一個極其重要的器官，其發揮的免疫功能是其他淋巴器官和造血器官所不能替代的。大量的研究已經逐漸明晰人類和一些模式動物脾臟的結構和功能，但是關于不同物種之間脾臟的結構及具體功能的差異程度目前還沒有深入研究，許多脾臟發育的潛在機制仍然不明確。今后隨著高通量測序技術的發展，利用先進的測序技術來研究脾臟發育過程中關鍵轉錄因子并挖掘免疫關鍵基因，這或將會為家畜抗病育種和人類脾臟疾病治療奠定基礎。