標記免疫檢驗技術(shù)綜述

楊麗霞

天津市靜海區(qū)醫(yī)院免疫科 （天津 301600）

標記免疫檢驗技術(shù)是指對已經(jīng)確定好的抗原或抗體通 過物質(zhì)進行標記，并通過測定標記物質(zhì)的含量獲得抗原-抗體的反應(yīng)結(jié)果，進而準確求出檢測抗原-抗體具體含量的一種技術(shù)，可以滿足臨床定性與定量分析的要求。標記免疫檢驗技術(shù)整個操作流程較為簡單快捷，已被廣泛應(yīng)用于免疫檢驗工作中[1]?，F(xiàn)階段，臨床所使用的標記免疫檢驗技術(shù)主要包括酶標記技術(shù)、熒光標記技術(shù)及化學發(fā)光標記技術(shù)等[2-3]。現(xiàn)將各種標記免疫檢驗技術(shù)的發(fā)展、特點及應(yīng)用綜述如下。

1 酶標記技術(shù)

酶標記技術(shù)的應(yīng)用要追溯到1971年的酶聯(lián)免疫吸附試驗，通過此項試驗，抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用被有效地結(jié)合起來，而且制備所得的酶標記物穩(wěn)定性更好、保存時間更長[4]。按反應(yīng)后的酶標記物是否分離結(jié)合和游離，可以將酶標記技術(shù)分為均相酶標記技術(shù)和異相酶標記技術(shù)兩種。

均相酶標記技術(shù)是利用酶作為標記物，在均勻的液相中進行的免疫檢驗技術(shù)，該技術(shù)在應(yīng)用過程中無需分離抗原抗體復合物，操作較為簡單。酶擴大免疫檢驗技術(shù)及克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)屬臨床上應(yīng)用較為廣泛的兩種均相酶標記技術(shù)。酶擴大免疫檢驗技術(shù)以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作為標記酶，標記酶可以將底物輔酶轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶，進而通過分光光度法進行測定。在克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)中，游離的酶供體標記抗原可以與酶受體結(jié)合，結(jié)合后可以形成帶有活性的全酶，且全酶活性與樣品中的待測蛋白含量呈一定的比例關(guān)系，根據(jù)這種比例關(guān)系可以間接計算目標蛋白含量[5-6]。克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)可用于血漿環(huán)孢菌素A 濃度的監(jiān)測，具有操作簡便、標本無需煩瑣的前處理、精密度好、線性范圍寬等優(yōu)點，更便于臨床實驗室應(yīng)用[6]。此外，均相酶標記技術(shù)在小分子抗原和半抗原的測定中應(yīng)用較為廣泛，如臨床通過應(yīng)用均相酶標記技術(shù)檢測尿液中香草苦杏仁酸的含量來診斷嗜鉻細胞瘤，同時，該技術(shù)還被用于霉酚酸血藥濃度的測定中[7-8]。

異相酶標記技術(shù)是對分離的酶標記物和游離的酶標記物進行測定的一種技術(shù)，其特點在于標記的酶本身活性不會發(fā)生改變，相比于均相酶標記技術(shù)，異相酶標記技術(shù)的臨床應(yīng)用更加廣泛。目前，酶聯(lián)免疫吸附檢驗技術(shù)是臨床上應(yīng)用最為廣泛的異相酶標記技術(shù)之一，主要用于傳染?。ㄈ缃Y(jié)核）和惡性腫瘤疾?。ㄈ绶伟┑脑\斷、血藥濃度檢測及食品安全評估等領(lǐng)域[9]。酶聯(lián)免疫吸附檢驗技術(shù)所采用的微孔板具有良好的吸附性，各個孔之間的差異較小。帶有琥珀酰亞胺酯活化的微孔板具有反應(yīng)充分、使用方便快捷的優(yōu)點。目前，日本所推出的AIA-1800和G7免疫分析系統(tǒng)具有較高的靈敏度，實際檢測時間較短，線性范圍較寬[10]。此外，近年來，臨床所應(yīng)用的放大系統(tǒng)使酶標記技術(shù)的靈敏度也得到了大幅提升，如底物循環(huán)、生物素-親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)、酶-抗酶復合物系統(tǒng)、催化受體沉積技術(shù)、微顆粒放大技術(shù)等，尤其是催化受體沉積技術(shù)，可以避免酶和抗體的直接連接，體系的靈敏度可以被放大2個數(shù)量級[11-12]。在此基礎(chǔ)上，異相酶標記技術(shù)逐漸開始與其他技術(shù)結(jié)合，如聯(lián)合聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)的聚合酶鏈式反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)、聯(lián)合固相膜滲濾技術(shù)的斑點-酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，這些聯(lián)合應(yīng)用的標記免疫檢驗技術(shù)避免了標記反應(yīng)過程中酶活性的降低，且整個操作流程簡單快捷，促進了酶免疫檢驗技術(shù)在深度與廣度方面的發(fā)展，從而能夠更好地為臨床提供服務(wù)[13-15]。

2 熒光標記技術(shù)

20世紀90年代，熒光標記免疫檢驗技術(shù)在整個標記免疫檢測方法學中占據(jù)著十分重要的地位，且發(fā)展十分迅速，同時其仍是目前標記免疫檢驗技術(shù)中最有發(fā)展前途的技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于食品安全、血漿特定蛋白測定及血清腫瘤標志物的檢測[16-17]。傳統(tǒng)的熒光標記免疫檢驗技術(shù)常用有機熒光染料如四乙基羅丹明、異硫氰基熒光素等作為標記物，該測定方法極易受到散射光和背景熒光等因素的影響，分析靈敏度較低，臨床應(yīng)用范圍受到一定的限制[18]。時間分辨熒光免疫檢驗技術(shù)所使用的標記物不再是有機熒光染料，而是鋱、銪等標記抗體或抗原，銪可以在紫外光作用下產(chǎn)生較強的熒光且衰變時間較長（通常可達60～900 μs），該技術(shù)的特異度、靈敏度均較高，靈敏度甚至可達10-19mol/L 的水平[19-20]。熒光納米微粒為一種應(yīng)用于熒光標記的新型生物分子標記物，通過改變微粒直徑可以獲得不同顏色的材料，包被熒光微粒的微球可以作為固相反應(yīng)載體和熒光親和試劑，在信號檢測中發(fā)揮十分重要的作用，該技術(shù)的靈敏度較高，其優(yōu)勢在于可以有效標記免疫球蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白，臨床上可以用于C 反應(yīng)蛋白檢測[21-22]。近年來，多重熒光標記技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于臨床，該技術(shù)可以同時測定多個待測樣本，大大提高了檢測效率。此外，基于熒光標記技術(shù)所研發(fā)的試劑盒也逐漸被應(yīng)用于臨床，如DNA 核酸類、多肽和蛋白類熒光標記試劑盒等，上述試劑盒大多具有較高的檢測靈敏度和特異度，市場應(yīng)用前景良好。

3 膠體金標記技術(shù)

膠體金標記免疫檢驗技術(shù)以膠體金為標記物，固相載體則可以選用硝酸纖維素膜，繼而形成紅色免疫反應(yīng)物質(zhì)，并可被肉眼直接觀察，因此，該技術(shù)可用于定性或半定量的快速免疫檢測，臨床應(yīng)用更加方便，已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷與床邊檢測[23-26]。此外，膠體金標記的免疫反應(yīng)簡便快捷，其相關(guān)的試劑盒價格也較為低廉，可以更好地應(yīng)用于傳染病、藥物濫用、腫瘤標志物、寄生蟲及中藥材活性成分等的檢測[27]。

4 化學發(fā)光標記技術(shù)

化學發(fā)光標記技術(shù)是指在待檢測的分子上連接可激活發(fā)光的化合物的方法。直接化學發(fā)光標記技術(shù)所測定的標記物質(zhì)以吖啶酯類為主，其特點為不易受到外界因素的干擾，標記過程亦相對較為簡單，臨床上主要用于膽紅素、維生素D 等的檢測[28-29]。酶標記化學發(fā)光分析技術(shù)使用酶標記抗體或抗原后可以形成酶標記的抗原-抗體復合物質(zhì)，可以催化化學發(fā)光底物發(fā)光，臨床上大多用于甲狀腺激素的檢測，用以評估甲狀腺功能[30-31]。電化學發(fā)光通過應(yīng)用電促發(fā)光技術(shù)可以確保能量傳遞參與到化學反應(yīng)中，如通過應(yīng)用N-羥基琉酰胺酯標記抗體或抗原，可以使三丙胺參與到化學反應(yīng)中，從而能夠準確反映樣品中抗原或抗體的含量，臨床上大多用于乙肝表面抗原的檢測，用于評價乙肝的感染情況[32-34]。

5 小結(jié)

近年來，隨著臨床免疫檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，除了已得到廣泛應(yīng)用的酶標記技術(shù)、熒光標記技術(shù)、膠體金標記技術(shù)及化學發(fā)光標記技術(shù)外，以免疫濁度測定自動化和標記免疫測定自動化為主的標記自動化技術(shù)因應(yīng)用更加方便、快捷而越來越被臨床重視。業(yè)界后續(xù)仍需進一步加大對標記免疫檢驗技術(shù)的研究力度，以更好地服務(wù)于臨床檢驗工作。