姜黃在嚙齒類實驗動物標認中的應(yīng)用

矯 建 張婷婷 鹿 麟 劉進朋

(大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心，大連 116021)

在進行醫(yī)學生物學及其他學科的實驗研究前，常常需要將實驗動物按適當?shù)囊筮M行分組和編號，那么就需要使用準確、迅速、可靠、簡便且安全的標認方法。鄧青松等[1]報道，實驗動物的標認方法，有染色法、剪腳趾法、剪耳朵法、耳朵打孔法、烙印法、號牌法等。其中，染色法是實驗室最常用及最易掌握的方法，苦味酸、硝酸銀等常用于染色標認動物，但目前此方法所使用的染料具有毒性、污染環(huán)境、難購買等缺點。本研究通過考察姜黃(Curcumae longae rhizoma)的皮膚毒性反應(yīng)，探討其標認實驗動物的可行性，既解決了上述染料存在的不足，又符合動物福利原則。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年健康皮膚無疾患的普通級白化豚鼠58只，雌雄各半，體質(zhì)量為250～350 g，6只用于染色標認考察，12只用于皮膚光毒性實驗(陽性對照組和樣品組各6只)，40只用于皮膚變態(tài)反應(yīng)實驗(其中，陽性對照組、陰性對照組各10只，樣品組20只)。成年健康皮膚無損傷的新西蘭白兔， 4只，體質(zhì)量為2.1～2.8 kg，用于多次皮膚刺激性實驗。實驗動物由大連醫(yī)科大學提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2018-0003。實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2016-0005。環(huán)境溫度21～23 ℃；相對濕度45%～57%；動物飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，動物飲水符合我國生活飲用水衛(wèi)生標準，在整個受試期間動物自由攝食飲水，實驗前在實驗動物房適應(yīng)3 d。本實驗已通過大連藥品檢驗檢測院福利倫理審查，審查編號：2020002。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃購自大連市藥品檢驗所中藥室；8-甲氧基補骨脂(8-MOP，C1523020，純度98%)及肉桂醛(WXBB1669V，純度93%)購自Sigma；HOPE-MED8130B皮膚光毒機購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1試藥及試劑配制

1.3.1.1姜黃提取物：將姜黃粉碎，過80目篩，稱取粗粉1 g 加 10 mL 75%乙醇混勻后，靜置過夜。取上清液進行實驗。

1.3.1.21 mg/mL 8-MOP溶液：稱取8-MOP適量，用無水乙醇溶解，混勻。

1.3.1.35%肉桂醛丙酮溶液：量取肉桂醛適量，用丙酮稀釋，混勻。

1.3.2染色效果考察：按九分法標號原則先左后右和由前至后。如圖1所示，根據(jù)孫敬方[2]方法，左前肢的斑點表示1號，腹部左側(cè)表示2號，左后肢表示3號，頭頂表示4號，腰背部表示5號，尾基部表示6號，右前肢表示7號，腹部右側(cè)表示8號，右后肢表示9號。標認后于1、7、14、21 d觀察及記錄著色情況。

圖1 九分法標號

1.3.3皮膚毒性考察

1.3.3.1多次皮膚刺激性實驗：實驗前24 h，將實驗動物背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，不損傷表皮，去毛范圍左、右各約3 cm×3 cm。取姜黃提取液0.5 mL直接涂在實驗動物皮膚上，然后用無菌敷貼和一層保鮮膜覆蓋，再用無刺激性膠布加以固定，另一側(cè)皮膚作為對照。每天涂抹一次，連續(xù)涂抹14 d。從第2天開始，每次涂抹前剪毛，用溫水清除殘留受試物，1 h后觀察結(jié)果，并進行評分。按下列公式計算每天每只動物平均積分，判定皮膚刺激強度，每天每只動物平均積分=(∑紅斑和水腫積分/受試動物數(shù))/14。

1.3.3.2皮膚光毒實驗：實驗前24 h，將豚鼠脊柱兩側(cè)皮膚去毛，實驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。備4 塊去毛區(qū)(圖 2)，每塊去毛面積約為 2 cm×2 cm。將豚鼠固定，在去毛區(qū)1和去毛區(qū)2涂敷0.2 mL姜黃提取液。涂敷30 min 后，進行光照。左側(cè)用鋁箔復蓋，膠帶固定，右側(cè)用紫外線A波段(365 nm)進行照射，照射劑量為10 J/cm2。結(jié)束后分別于1、24、48和72 h觀察皮膚反應(yīng)，判定每只動物皮膚刺激反應(yīng)積分。單純涂受試物而未經(jīng)照射的區(qū)域(即1區(qū))未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域(即2區(qū))出現(xiàn)皮膚刺激反應(yīng)積分≥2的動物數(shù)為1只或1只以上時，判定受試物具有光毒性。以1 mg/mL的8-MOP溶液為陽性對照物，同法操作。

圖2 皮膚光毒實驗去毛區(qū)

1.3.3.3皮膚變態(tài)反應(yīng)：實驗前24 h，將豚鼠背部左側(cè)去毛4～6 cm2。取姜黃提取液和5%肉桂醛約0.2 mL分別涂在豚鼠去毛區(qū)皮膚上，以無菌敷貼和一層保鮮膜覆蓋，再以無刺激膠布封閉固定6 h。第7天和第14天以同樣方法重復一次。末次誘導后14 d，將0.2 mL姜黃提取液涂于豚鼠背部右側(cè)2 cm×2 cm去毛區(qū)(接觸前24 h脫毛)，然后用同樣方法固定6 h。激發(fā)接觸后24 h 和48 h 觀察皮膚反應(yīng)。當受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時，判為該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性，并判定受試物的致敏強度。實驗同時設(shè)陰性對照組，在誘導接觸時僅涂以75%乙醇為陰性對照，在激發(fā)接觸時涂以姜黃提取液。陽性對照組，以5%肉桂醛丙酮溶液為陽性對照，同受試物的實驗方法操作，陽性對照組的皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性率應(yīng)大于30%。

2 結(jié)果

2.1 染色效果

如圖3所示，編號為1和2的兩只豚鼠的姜黃染色，直到21 d依然清晰可見。姜黃提取物的染色性能優(yōu)良，色彩明亮鮮艷，具有較好著色效果。

圖3 姜黃提取物染色效果的變化

2.2 皮膚毒性實驗結(jié)果

2.2.1多次皮膚刺激性實驗結(jié)果:見表1所列。14 d，每只家兔的皮膚均未出現(xiàn)紅斑水腫，皮膚積分均值為0，每天每只動物平均積分為0，說明姜黃提取物對皮膚無刺激性。

表1 姜黃提取物對家兔多次皮膚刺激性實驗結(jié)果

2.2.2皮膚光毒實驗結(jié)果：單純涂敷陽性對照物而未經(jīng)照射的區(qū)域未出現(xiàn)皮膚光毒反應(yīng)，而涂敷陽性對照物經(jīng)照射的區(qū)域在24 h時均出現(xiàn)皮膚重度紅斑及輕微水腫，并隨著時間延長慢慢消退，皮膚反應(yīng)積分均≥2(表2)。涂敷姜黃提取物而未經(jīng)照射的區(qū)域以及經(jīng)照射的區(qū)域均未出現(xiàn)皮膚光毒反應(yīng)，說明姜黃提取物無光毒性(表3)。

表2 陽性對照物對豚鼠皮膚光毒性實驗結(jié)果

表3 姜黃提取物對豚鼠皮膚光毒性實驗結(jié)果

2.2.3皮膚變態(tài)反應(yīng)結(jié)果:陽性對照組的皮膚均出現(xiàn)紅斑，其中5只為輕微紅斑，4只紅斑較重并伴有輕微水腫，1只為嚴重紅斑伴有輕微水腫，皮膚反應(yīng)評分≥2的動物數(shù)為5只，皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性率為50%，大于30%符合實驗要求，陰性對照組的皮膚未出現(xiàn)紅斑水腫，皮膚反應(yīng)積分≥2的動物數(shù)為0只(表4)。樣品組皮膚未出現(xiàn)紅斑水腫，皮膚反應(yīng)積分≥2的動物數(shù)為0只，說明姜黃提取物無致敏性。

表4 豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果

3 討論

國內(nèi)外傳統(tǒng)實驗動物的標認有許多方法，包括耳部標認、籠上標認、金屬材料打箍的標認、剪趾標認、染色標認等。以上傳統(tǒng)方法，適用于不同實驗，各有其優(yōu)缺點。耳部標認方法雖然快速、方便，但造成一定損傷、籠上標認方法適用范圍有限，且易搞亂或遺失標牌、金屬材料打箍的標認方法會妨礙實驗動物的發(fā)育生長、剪趾標認只適宜于小、大鼠等。豚鼠的足趾短而寬,不適用上述方法[3]。而染色法適用范圍廣泛，具有快速、簡單、方便、不會給實驗動物造成損傷和痛苦等特點。趙寒昕等[4]報道，常用的染色劑有3%～5%苦味酸溶液、0.5%中性紅或品紅溶液、2%硝酸銀溶液、煤焦油酒精溶液及甲紫溶液。由于染色劑、實驗動物、環(huán)境等原因，易造成染色標認褪色及模糊不清，而且常用染色劑的毒性對實驗動物和環(huán)境的影響，以及難以購買的等問題也是需要注意的。

天然植物染料是從植物中獲得、很少經(jīng)過化學加工，無毒、無害且無污染。天然植物染料有紫草、青黛、姜黃等。本研究曾用紫草、青黛的乙醇或水的提取物進行染色標認，但易褪色且模糊不清，染色效果不佳。姜黃在全國多地種植易于購買，屬于活血化瘀中草藥，可提取黃色食用染料，也作為保健食品原料，具有良好的經(jīng)濟價值。姜黃染料的有效成分是姜黃中的姜黃素，又稱姜黃色素[5]，具有安全性高、熱穩(wěn)定性好、著色力強、色澤鮮亮等特點，有很大的開發(fā)價值。李然等[6]對姜黃素的安全性毒理學進行了評價，研究表明姜黃素屬實際無毒物質(zhì)，未見潛在的致突變、致微核及致畸作用，無明顯亞慢性毒性損害作用。本研究對姜黃提取物的皮膚毒性進行了考察，結(jié)果表明用姜黃提取物對實驗動物進行染色標認安全可靠，染色時間長，且不易褪色。

本研究考察了姜黃乙醇提取物的皮膚刺激性、皮膚光毒性及其著色度，結(jié)果表明其可用于豚鼠和大、小鼠等動物實驗中的標認，具有安全、低毒等優(yōu)點。下一步，希望通過其他物理和化學的方法對其進行改性，以提高其染色牢度[7-10]。