人參皂苷Rb1干預DSS誘導結腸炎模型小鼠轉錄組高通量測序及分析

董建一 李昶儀 陳大朋 王 亮 王福金 王靖宇 周子娟

(大連醫科大學實驗動物中心，大連 116044)

Castellano等[1]報道，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(DC)，不僅影響到胃腸，而且也廣泛到影響到其它器官。該病以往多見于西方國家，近年在我國發病率呈顯著上升趨勢[2]。IBD發病原因尚不明確，可能由宿主遺傳、免疫因素、微生物和環境共同引起[3]。因IBD病情具有反復發作、無法根除、治療費用高等特點，許多病人感覺痛不欲生稱其為“綠色癌癥”。Fiocchi等[4]和Zhang等[5]研究表明，編碼RNA構成了人類轉錄基因組的大部分，并在疾病狀態中發揮著關鍵作用，被認為是IBD重要治療靶點。其中，Zheng等[6]報道，極早期炎性腸病(VEO-IBD)應用測序技術揭示可能與潛在原發性免疫缺陷相關。綜上所述，結合IBD發病的綜合因素，應用高通量測序技術揭示其治療靶點的解決方案可能為該病的治療提供新的且有效的機會。

近年來，中草藥已被IBD患者廣泛作為補充和替代藥物使用。其中，人參譽為中國傳統藥物的“百草之王”被世界廣泛應用。作為人參的主要有效成份，目前人參皂苷已分離出40余種，而人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，Rb1)是其含量最多的一種[7]。人參皂苷Rb1主要來源于人參的莖、根和花芽，因其具有抗炎、抗氧化和神經保護作用而備受關注[8-9]，特別是Rb1已被證明在結腸炎中具有抗炎作用[10]。Dong等[11]報道，人參皂苷Rb1通過激活內質網E3泛素連接酶Hrd1信號通路緩解小鼠結腸炎，為Rb1治療IBD疾病提供了理論支持。

中草藥具有多靶點多通路的特點，因此應用高通量轉錄組測序技術，對人參皂苷Rb1干預的DSS誘導結腸炎模型小鼠的結腸組織通過 RNA樣品檢測、mRNA富集、雙鏈DNA合成、末端修復和加A接頭、片段選擇和PCR擴增構建cDNA文庫，然后進行Illumina測序，為進一步在分子層面闡述Rb1干預后DSS誘導結腸炎模型小鼠的作用機制，利用生物信息學進行信息對比，分析Rb1干預后差異性基因分析、GO功能富集以及KEGG 通路情況，探究人參皂苷Rb1在IBD中更多的生物學功能，以期為揭示人參皂苷Rb1干預DSS誘導結腸炎模型小鼠機理提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠 6～8周齡，15只，體質量18～22 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號： SCXK(遼)2015-0001。實驗動物飼喂養于大連醫科大學實驗動物中心，實驗單位使用許可證號：SYXK(遼)2018-0007。動物房室內溫度：19～23 ℃，相對溫度：40%～70%。實驗通過大連醫科大學倫理委員會審批，審批號：AEE20046。

1.1.2實驗動物分組：15只小鼠隨機分為正常組(對照組)、模型組(結腸炎模型組)及Rb1組(人參皂苷Rb1干預組)，每組5只。正常組，正常飲水；模型組，每天給予含有4%(m/v)DSS飲水，連續飲用7 d，建立結腸炎小鼠動物模型；Rb1組飲用含4%(m/v)DSS水的第2天開始每天采用灌胃方法給予1 mL/只(40 mg/kg)人參皂苷Rb1的水溶液，連續7 d。第9天處死小鼠，取結腸和腸內容物。

1.1.3主要試劑：人參皂苷Rb1(HPLC≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司；硫酸葡聚糖鈉(DSS)購自大連美侖生物技術有限公司；糞便DNA提取試劑盒，購自INVIKET；蘇木素-伊紅(HE染色液)購自上海金穗生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1DSS誘導結腸炎小鼠模型的指標評估：實驗第1天起，每天觀察并記錄小鼠的體質量、采食量、精神狀態、糞便狀況等基本信息，并根據表1進行疾病活動指數評分(DAI評分)。第9天小鼠應用安樂術處死小鼠，取小鼠全結腸并拍照，記錄結腸長度及肉眼觀察結腸炎癥損傷狀況。

1.2.2DSS誘導結腸炎小鼠模型的病理組織觀察：取出結腸段后用PBS清洗腸內容物，取小鼠遠端結腸組織(約1 cm)置于4%甲醛溶液中固定，然后進行石蠟包埋及切片，最后進行結腸組織HE染色分析其病理情況。

1.2.3RNA提取及文庫建立：采用TRIzol(Ambion)法提取結腸組織總RNA，然后進行質控分析。分別用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本是否存在DNA污染，NanoPhotometer和Agilent 2100進行純度和完整性分析。通過Oligo(dT)磁珠富集mRNA，然后加入限制性內切酶緩沖液隨機打斷mRNA，以mRNA為模板通過逆轉錄合成cDNA第一鏈，以dNTPs為原料合成第二鏈。純化后的雙鏈cDNA經末端修復及加A尾并連接測序接頭，篩選200 bp cDNA后，進行PCR擴增和純化構建測序文庫。

1.2.4轉錄組測序及數據分析：文庫構建后，使用Qubit2.0進行初步定量，使用 Agilent 2100對插入片段大小檢測，應用qRT-PCR對文庫有效濃度準確定量，保證文庫質量。將不同文庫按照有效濃度及目標數據(正常組、模型組、Rb1組)需要混合后進行Illumina高通量測序。測得圖像數據經CASAVA堿基識別化為序列數據(reads)。對原始數據(raw data)進行質控，通經過原始數據過濾去除低質量測序數據、接頭序列及rRNA序列獲得分析使用的數據(clean reads)。

1.2.5GO功能富集和KEGG通路富集分析：采用clusterProfiler軟件對差異基因進行GO功能富集及KEGG通路富集分析。富集分析結果是每個差異比較組合的所有差異基因集；上調差異基因集；下調差異基因集進行富集。GO功能富集，差異表達基因對比Gene Ontology數據庫，分別從分子功能、生物過程和細胞組成三部分進行分析，P<0.05為顯著富集。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通過對KEGG通路編號對應的功能描述預測參與的代謝途徑。以P<0.05為顯著富集，篩選差異表達基因中顯著富集的代謝途徑。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 DSS誘導結腸炎小鼠模型各項評估指標

三組小鼠狀態：正常組小鼠狀態良好，體質量無明顯變化；模型組小鼠反應不靈活精神狀態欠活躍；模型組和Rb1組小鼠在4%(m/v)DSS誘導的第3天出現便血、腹瀉等現象，體質量變化如圖1 A所示：實驗第3天，模型組與正常組小鼠相比，體質量明顯減輕(P=0.0006<0.01，t=5.53)，第7天體質量下降最為顯著(P<0.0001，t=10.68)。Rb1組小鼠的體質量第3天明顯低于正常組(P<0.0001，t=7.33)，第6天與模型組相比體質量明顯回升(P=0.0029<0.01，t=4.22)。DAI評分如圖1B所示：實驗第3天以正常組為參照，其它兩組DAI評分均進行性增高，模型組(P<0.0001，t=16.65)，Rb1組(P<0.0001，t=14.14)。實驗第6天，Rb1組與模型組相比，DAI評分顯著降低(P=0.0035，t=4.08)。結腸外觀變化如圖1C所示：肉眼觀察小鼠結腸組織，正常組小鼠的結腸組織管壁比較光滑具有彈性，而模型組和Rb1組的小鼠結腸組織均有不同呈度的紅腫現象，而且模型組小鼠腸黏膜糜爛并且腸腔伴有血便。結腸長度量化指標如圖1D所示：與正常組相比，模型組結腸長度顯著縮短(P<0.0001，t=7.34)，與模型組相比，Rb1組結腸長度縮短程度顯著得到了抑制(P=0.008<0.01，t=3.50)。以上結果說明，人參皂苷Rb1能夠緩解DSS誘導的結腸炎小鼠模型的癥狀。

圖1 DSS誘導結腸炎小鼠模型各項評估指標

2.2 DSS誘導小鼠結腸炎模型組織病理學檢測

為進一步證明Rb1能夠緩解DSS誘導小鼠結腸炎模型癥狀，分別將正常組、模型組和Rb1組小鼠的結腸組織做成切片，用HE染色進行組織病學檢測，結果如圖2所示：光鏡下，正常組未見炎癥浸潤的細胞，且組織結構完好；模型組腸黏膜層可見大量的以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，且組織結構破壞嚴重；Rb1組腸黏膜可見點狀侵蝕，但黏膜下層炎癥細胞浸潤較輕。

圖2 小鼠結腸組織HE染色

2.3 轉錄組測序分析

2.3.1測序數據質量分析：通過Illumina高通量測序平臺對正常組、模型組及Rb1組小鼠結腸樣本進行轉錄組測序，獲得原始數據中(raw reads)和原始數據過濾后的序列數據(clean reads)。數據質量分析如表1所示：各組樣本的clean bases均在7 G以上，堿基質量超過Q20(Phred=-10log10(e)數值大于20的堿基占總堿基的百分比)和Q30(Phred=-10log10(e)數值大于30的堿基占總堿基的百分比)的比例均在92%以上，各樣本的GC含量(clean reads 中G與C占4種堿基的百分比)均在50%左右。以上數據說明測序組裝效果理想，符合后續分析要求。

表1 轉錄組測序數據質量分析

2.3.2基因表達相關性分析：樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。因此，為確保后續差異基因分析得到可靠結果，根據FPKM值，計算組內及組間樣本的相關性系數，樣相系數越接近于1，表明樣品之間表達模式的相似度越高。如圖3所示，基因表達相關性分析熱圖及R語言進行皮爾遜相關系數的計算(R2)得出，正常組、模型組及Rb1組，樣品的R2均大于0.90，說明樣本間表達模式相似度高，選用的樣本合理實驗具有可靠性。

圖3 基因表達相關性分析

2.3.3差異表達基因分析:正常組、模型組及Rb1組三組之間差異基因的重疊情況如圖4A所示，Rb1組和模型組共有差異性基因785個，模型組和正常組差異性基因450個，三組之間重疊差異基因384個。差異顯著性基因的整體分布情況，Rb1組和模型組對比，共篩選出差異性基因1 169個，其中基因表達上調為1 008個，表達下調為161個。結果如圖4B所示：火山圖(Volcano Plot)顯示，利用t檢驗分析出Rb1組和模型組之間顯著差異表達的基因后，以log2(Fold Change)為橫坐標，表示基因在不同樣中的表達倍數變化(log2Fold Change)；以t檢驗顯著性檢測P值的負對數-log10(padj)為縱坐標，表示表達差異顯著性水平。圖中每個點代表一個特定基因，其中上調基因用紅色點表示，下調基因用綠色點表示，藍色為表達無變化的基因。

圖4 差異基因韋恩圖和火山圖分析

2.3.4差異表達基因GO富集和KEGG分析

對Rb1干預前后結腸炎模型小鼠結腸組織差異基因進行GO顯著性富集分析，結果如表1所示，共有10 450個差異表達基因得到GO注釋。其中，MF(1 411)占總差異基因的13.50%、BP(7 182)占總差異基因的68.73%以及CC(1 857)占總差異基因的17.77%。為進一步分析Rb1轉錄組的unigenes功能，進行了KEGG通路富集分析，對基因組、化學和系統功能信息的綜合性數據進行了整合。

結果如表2和圖5所示，從KEEG富集結果中選取最顯著的20個通路繪制成散點圖，對轉錄組信息進行分析得出：30個基因與神經活動配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)有關，23個基因與鈣離子信號通路有關以及21個基因與cAMP信號通路有關。

表2 差異表達基因KEGG功能分類

圖5 KEGG 通路富集最顯著前20個通路氣泡圖

3 討論

人參皂苷Rb1能夠緩解4%(m/v)DSS誘導結腸炎模型小鼠的癥狀。人參皂苷Rb1干預后顯著抑制了IBD模型小鼠的體質量下降、DAI評分降低、結腸長度縮短以及較輕的黏膜下層炎癥細胞浸潤。以上研究結果說明：4%(m/v)DSS誘導IBD小鼠模型成功，并且人參皂苷Rb1對該小鼠模型具有保護作用，為高通量測序提供理想的檢測樣本。

本研究通過構建正常組小鼠、DSS誘導炎腸病模型小鼠及Rb1干預DSS誘導IBD模型小鼠的轉錄組文庫，獲得轉錄組測序分析使用數據clean reads。測序數據質量分析顯示，各組Q20和Q30比例均高于92%，GC含量均在50%左右，以上結果表明測序數據完整性好，符合后續分析的要求。為檢驗實驗可靠性以及樣本選否合理，對樣品間基因表達相關水平進行檢測，皮爾遜相關系數的計算(R2)結果顯示，三組樣相關系數均大于0.9，說明了樣本之間表達模式相似度高，選用的樣本合理具有可靠性。

為了挖掘Rb1干預后DSS誘導IBD模型小鼠相關的目的基因，將正常組、模型組及Rb1組的基因進行重疊生物學信息分析，以及對Rb1組和模型組的上調基因和下調基因分析，這更好的挖掘到Rb1干預后的基因功能。

GO數據庫對Rb1干預前后IBD模型小鼠結腸組織差異基因進行GO富集分析，共找出10 450個差異表達原基因，其中MF有1 411個基因占13.50%，CC有1 857個基因占17.77%，BP有7 128個基因占68.73%。KEGG富集結果中，選取最顯著的20個通路進行分析得出，與Rb1干預后密切相關的通路為鈣離子信號通路、神經活動配體-受體相互作用通路以及cAMP信號通路，以上結果更有利于明確差異表達基因在生物代謝中發揮的功能以及與其他基因的相互作用。