熱應激對ICR雌性小鼠超數排卵及卵泡發育的影響*

田永路 李 娜 田 禎 曾申明 朱德生

(1.北京大學實驗動物中心，北京 100871)(2.中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

對于家畜等大多數恒溫動物來講，外界環境溫度的變化超過動物機體的調節和適應區間時，導致大量熱積于體內，使體溫升高，從而出現繁殖機能障礙。一些研究[1-4]發現熱應激能夠抑制幼齡母牛和成年母牛的卵泡發育和功能以及促進卵子凋亡，而另一些研究[5-6]發現短時間的熱應激對于在體外培養的卵子影響不大，因此判斷，熱應激對于離體和在體卵子發育的影響有所不同。

本研究主要探討短期熱應激對小鼠超數排卵和卵泡發育的影響，而卵泡閉鎖又是卵巢卵泡發生過程中的重要生理現象。雌性動物從胚胎發育早期到出生時，卵巢中儲存的大量卵原細胞開始發育，而絕大多數卵母細胞隨著卵泡閉鎖而凋亡，因此卵泡閉鎖對于維持卵巢正常的生理功能具有非常重要的作用。如果卵泡閉鎖出現異常，將對動物繁殖功能造成一定的影響。

1 材料和方法

1.1 動物選擇與分組

7～8周齡的SPF級ICR小鼠20只，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，小鼠飼養于北京大學實驗動物中心屏障環境內，相對濕度40%～70%，溫度22～26 ℃，在設施內適應3 d后進行實驗。將20只小鼠隨機分為對照組(25 ℃)和熱應激組(38 ℃)，每組10只。實驗通過北京大學福利倫理審查，編號：LAC-ZhuDS-1。

1.2 儀器及試劑

200 L生化培養箱和烘箱(上海一恒科學儀器有限公司)，CO2檢測儀(河南省保時安電子科技有限公司)，電子體溫計(臨海醫療儀表廠)，離心機(Eppendorf)，注射器(浙江京環醫療用品有限公司)，冰箱(海爾)，切片機(Leica)，顯微鏡(Olympus)等。雙蒸水(Millipore)，梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)和二甲苯(北京市通廣精細化工公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色液、明膠、中性樹膠、4%甲醛、1.25%的三溴乙醇和操作液M2(Sigma)，以及10%鹽酸乙醇(北京化學工業集團)。

1.3 實驗處理

1.3.1熱應激設備的預處理：實驗前，采用CO2檢測儀進行檢測，當濃度為1 796.31 mg/m3時，其排放率為359.26 mg/m3/min，而實驗小鼠的CO2排放速度每只為7.19～10.78 mg/m3/min。因此，上述生化培養箱能夠同時進行30只小鼠的熱應激處理。

1.3.2熱應激前后的超數排卵處理：為了排除在熱應激前形成的腔前卵泡和排卵前卵泡對實驗結果的影響，本實驗將用于測試的雌性小鼠在熱應激之前，進行同期化超數排卵處理。熱應激6 d后，再進行一次超數排卵處理，然后處死小鼠，取輸卵管卵子以及卵巢。具體超數排卵處理為小鼠腹腔注射10 IU的孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后注射10 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)。熱應激組小鼠完成連續6 d的熱應激處理的同一天注射hCG。

1.4 實驗設計

對照組小鼠飼養于屏障環境內，溫度控制在25 ℃，相對濕度40%～70%；熱應激組小鼠，每天08∶00將小鼠放入38 ℃(實測溫度在37～39 ℃)的生化培養箱中，熱應激10 h，培養箱內相對濕度：40%～60%(培養箱底層放置水盤)，熱應激期間自由采食和飲水，每天18∶00熱應激結束后，將小鼠放回25 ℃屏障環境內飼養，連續處理6 d后，進行超數排卵處理，記錄小鼠體質量后，采用1.25%的三溴乙醇對小鼠進行安樂死。

1.4.1卵母細胞的獲取：75%乙醇消毒后，打開控溫臺。用操作液M2制作操作微滴：每滴50 μL(對每個液滴進行編號)；制備移卵管。將對照組和熱應激組的輸卵管置于微滴中，用尖頭鑷子劃開膨大部，卵母細胞釋放到操作液中。將含卵母細胞的團塊轉移至含0.3 mg/mL透明質酸酶操作液中，反復吹吸至卵丘細胞脫落。將脫凈的卵母細胞，放入附近的新液滴中洗凈后，顯微鏡下觀察拍照。

1.4.2卵巢的獲取及蘇木素-伊紅(HE)染色：將處死后的小鼠置于消毒后的操作臺上，用75%乙醇對其腹部(朝上)進行消毒處理。剪開腹部皮膚和腹膜，摘取卵巢置于4%甲醛中固定保存。將固定好的卵巢制成石蠟切片，并取每個卵巢的最大面，連續切取三張，每張切片的厚度約為2 μm，然后進行HE染色以及后續的觀察。

1.4.3卵巢卵泡形態觀察：每只小鼠的一側卵巢都取最大截面制作出一張HE切片，置于光學顯微鏡下進行觀察。在視野下，統計所有卵泡總數(包括初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡，不包括原始卵泡)，閉鎖卵泡數(顆粒細胞排列不規則及脫離卵泡壁)，如圖1所示，計算總閉鎖率(總閉鎖率=閉鎖卵泡/所有卵泡×100%)。

圖1 HE染色閉鎖卵泡判斷標準(×200)

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 熱應激對小鼠超數排卵的影響

通過對熱應激組和對照組小鼠超數排卵情況的統計分析，發現熱應激組的超排卵數高于正常對照組，熱應激組為(55.10±6.16)個，對照組為(32.60±4.95)個，且兩組之間存在顯著性差異(P<0.05)。熱應激組的正常卵泡數和異常卵泡數均高于對照組，熱應激組正常卵泡數為(16.20±4.51)個，對照組為(8.60±2.73)個；熱應激組異常卵泡數為(38.90±6.69)個，對照組為(24.00±4.61)個，但兩種卵泡數均不存在顯著差異(圖2，P>0.05)。以上結果說明熱應激只是影響超數排卵的總體數量，但并未影響正常發育卵泡的數量。

圖2 排卵情況比較

2.2 熱應激對卵巢總卵泡數和黃體數的影響

通過對卵巢切片HE染色后卵泡和黃體的統計分析，研究發現熱應激組的總卵泡數明顯高于對照組，熱應激組為(30.25±9.16)個，對照組為(20.00±3.46)個，并且兩組之間存在顯著性差異(圖3a，P<0.01)。熱應激組黃體數高于對照組，熱應激組為(9.50±1.77)個，對照組為(7.50±0.93)個，并且兩組之間存在顯著性差異(圖3b，P<0.01)。以上結果說明，熱應激不僅影響到了超數排卵后總卵泡數，并且影響到成熟的卵泡正常排卵形成黃體過程。

圖3 卵巢切片HE染色后總卵泡數與黃體數比較

2.3 熱應激對卵泡閉鎖的影響

進一步分析熱應激對于卵泡閉鎖的影響，研究發現熱應激組閉鎖卵泡數高于對照組，熱應激組為(4.80±1.15)個，對照組為(1.60±0.48)個，并且兩組之間存在顯著性差異(圖4a，P<0.05)，而熱應激組卵泡閉鎖率高于對照組，但是兩組之間差異不顯著(圖4b，P>0.05)。以上結果說明38 ℃熱應激處理嚴重影響卵泡的閉鎖。

圖4 卵泡閉鎖情況比較

3 結論與討論

小鼠進行同期化超數排卵處理，熱應激6 d后再進行超數排卵處理，發現熱應激組小鼠的超排卵數、正常卵泡數和異常卵泡數均高于對照組小鼠，并且超排卵數較對照組，存在顯著差異(P<0.05)。通過對卵巢切片HE染色的觀察，發現熱應激組的總卵泡數和黃體數均明顯高于對照組，并且兩組之間存在極顯著性差異(P<0.01)，而卵泡閉鎖率，熱應激組高于對照組，但是兩組之間不存在顯著差異(P>0.05)。

從目前研究結果可以發現，熱應激6 d對雌性小鼠超數排卵有一定影響，這與李頌孫[7]報道的結果類似。另外，閉鎖卵泡升高說明熱應激能夠導致雌性小鼠繁殖功能的下降，這與Wilson等[8]發現熱應激抑制卵泡發育與其功能的結果一致，但其機制尚不很清晰。Andreu-Vázquez等[9]研究也發現熱應激會導致牛卵子加速老化，以及Tilly等[10]發現禽、豬、綿羊和牛在卵泡閉鎖時，伴隨顆粒細胞凋亡的現象。不同的熱應激條件是否會引起卵泡中顆粒細胞凋亡，從而切斷顆粒細胞為卵子提供營養的途徑，最終造成卵泡閉鎖，還是存在其他因素，具體作用機制需要更加深入的研究和探討。