益生菌快速檢測技術(shù)研究進展

呂秀莉 - 李柏良 -ang 霍貴成 - 岳瑩雪 - 郭佳瑤 -

(東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

益生菌廣泛存在于人和一些動物腸道中，傳統(tǒng)研究用的益生菌主要包括雙歧桿菌、乳桿菌和酵母菌等，這些益生菌在維持腸道內(nèi)菌群平衡、治療便秘和腹瀉、增強機體免疫力、降低血清膽固醇、改善肥胖、延緩衰老和抗腫瘤等方面起著重要的作用[1-4]。近年來，“腸—腦軸”和“腸—肝軸”等概念的提出，更使人們認識到益生菌可以通過改變腸道菌群狀況來調(diào)控宿主的情緒和認知情況，并通過腸道與其他器官的雙向交流實現(xiàn)對其他器官疾病的預(yù)防[5-6]。與傳統(tǒng)益生菌對某些疾病起到緩解與預(yù)防的作用不同，下一代益生菌的相關(guān)研究是以治療疾病為核心[7-8]，目前下一代益生菌的主要研究對象為梭菌屬中的柔嫩梭菌和丁酸梭菌、擬桿菌屬中的脆弱擬桿菌和卵形擬桿菌以及嗜黏蛋白—阿克曼氏菌等，且其在某些疾病的治療中起到積極作用[9-10]。

隨著益生菌研究的逐漸深入，不論是在食品或保健產(chǎn)品的質(zhì)量管控方面還是在新型益生菌的研究方面，益生菌的檢測與篩選工作都是十分重要的。腸道內(nèi)的益生菌大多為厭氧菌，培養(yǎng)條件較為苛刻，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法周期長，過程繁瑣，難以滿足快速檢測的需要[11]。文章擬對益生菌的檢測方法進行綜述，并展望快速檢測方法的發(fā)展前景，旨在為進一步提高中國食品的品質(zhì)提供一定參考。

1 免疫學檢測技術(shù)

1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是目前發(fā)展較為完善的免疫學檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附檢測時，抗原(抗體)首先結(jié)合在固相載體表面，此時該抗原(抗體)仍保留其免疫活性，再加入一種同樣保持著免疫活性的抗體(抗原)與酶結(jié)合而成的復(fù)合物，最后加入底物與酶作用，利用底物與酶發(fā)生的顯色反應(yīng)對樣本中微生物進行定性和定量分析與檢測[12-13]。

在益生菌檢測方面，雙抗體夾心ELISA技術(shù)可應(yīng)用于雙歧桿菌等傳統(tǒng)益生菌的檢測，其基本原理如圖1所示。傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)具有操作簡單方便、適用范圍廣和效率高等諸多優(yōu)點，但其在靈敏度和特異性方面有所不足，雙抗體夾心-ELISA技術(shù)由于增加了一層抗體，使得檢測的靈敏度進一步提高。袁耀武等[14]制備了鼠和兔抗長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的免疫血清，利用雙抗體夾心ELISA法成功檢出了發(fā)酵乳制品中的雙歧桿菌，試驗過程耗時8 h，檢測的最低濃度為107CFU/mL。

1.2 電化學免疫傳感器檢測技術(shù)

電化學免疫傳感器檢測技術(shù)是建立在傳感技術(shù)與抗原—抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的檢測技術(shù)，其中電極被用作固定載體和傳感元件，抗原(抗體)作為敏感元件，經(jīng)固定化技術(shù)與電極表面結(jié)合，產(chǎn)生的反應(yīng)信號會轉(zhuǎn)換為容易測量的電信號，實現(xiàn)對待測物的定量檢測[16]。

在益生菌檢測方面，Xue等[17]使用電化學磁珠免疫傳感器對乳制品中的鼠李糖乳桿菌進行了檢測，通過將磁珠與針對鼠李糖乳桿菌菌毛亞基 SpaA 的特異性抗體偶聯(lián)，捕獲樣本中的鼠李糖乳桿菌，然后加入酶標記的抗體進行反應(yīng)，最后分離免疫復(fù)合物，用電極測量電流信號的變化。試驗證明電化學磁珠免疫傳感器檢測鼠李糖乳桿菌具有特異性，不與其他乳酸菌發(fā)生交叉反應(yīng)，且檢出限低。在新型傳感器的制備與應(yīng)用方面，Zhao[18]將金納米粒子電沉積在電極表面，制備了一種超靈敏電化學免疫傳感器，制備方案如圖2所示，將其用于短乳桿菌的檢測，并對影響傳感器傳感效果的因素進行了研究。由于采用了夾心結(jié)構(gòu)，其所設(shè)計的電化學免疫傳感器可以在104～109CFU/mL范圍內(nèi)線性檢測短乳桿菌。

圖1 雙抗體夾心ELISA檢測法原理與流程圖[14-15]Figure 1 Flowchart of modified double antibody sandwich-ELISA

1.3 不同標示物的免疫層析檢測技術(shù)

免疫層析(ICTS)的原理與ELISA相似，其區(qū)別為免疫層析技術(shù)中免疫反應(yīng)是在硝酸纖維素膜等載體上通過毛細管遷移進行的，依靠被標記的抗體作為視覺信號來檢測樣本中的抗體特異性抗原[19]。免疫層析技術(shù)作為一類快速檢測技術(shù)備受重視，傳統(tǒng)的免疫層析方法大多以膠體金作為標示物，通過金顆粒在檢測線處的聚集對待檢物進行定性或者半定量檢測，檢測靈敏度較低，且最早的試紙條只能用來檢測單種目標物[20]。因此，除常規(guī)的膠體金外，其他許多優(yōu)良的新型標示物也被用于免疫層析技術(shù)中，在微生物檢測中發(fā)揮重要作用。以新材料為標示物的免疫層析技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用詳見表1。

隨著分子生物學技術(shù)不斷成熟以及各學科的交叉應(yīng)用越來越普遍，近年來在免疫層析技術(shù)的應(yīng)用中除開發(fā)更多新型標示物外，與核酸擴增技術(shù)相結(jié)合的免疫層析試紙條也逐漸被開發(fā)出來。此類試紙條可以在核酸層面對樣品進行檢測，因此相比于傳統(tǒng)免疫層析法來說具有更高的靈敏性和特異性[29]。陳詩勝等[30]結(jié)合PCR技術(shù)開發(fā)了檢測致奶牛乳房炎的無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌4種重要致病菌的核酸免疫層析試紙條方法，結(jié)果顯示用此方法檢測4種菌的靈敏度比凝膠電泳提高了10～100倍。

綜上，免疫層析技術(shù)已在致病菌等微生物的檢測中發(fā)揮重要作用，而在益生菌檢測方面的應(yīng)用較少，隨著生活水平的進一步提高，人們對于食品的關(guān)注將不僅限于其安全性，對食品品質(zhì)及功能性也會有更高的要求，免疫層析技術(shù)將因其快速簡便的特點在益生菌的檢測中發(fā)揮極大作用。

2 分子生物學檢測技術(shù)

微生物遺傳信息的相對穩(wěn)定，使針對微生物DNA特

圖2 短乳桿菌免疫傳感器的制備方案[18]Figure 2 Scheme of preparation of Lactobacillus brevis immunosensor

表1 在免疫層析技術(shù)中應(yīng)用的新型納米材料Table 1 Application of new nanoparticles in ICTS

異性序列的分子生物學檢測技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。不同的分子生物學檢測技術(shù)其應(yīng)用范圍不同，且分子生物學檢測技術(shù)已經(jīng)不局限于單個技術(shù)的推廣與應(yīng)用，而是趨向多種技術(shù)互相結(jié)合、優(yōu)勢互補，不僅大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，而且在檢驗結(jié)果的精度上也有所提高，為實現(xiàn)高通量檢測創(chuàng)造了條件，促進了微生物檢測技術(shù)的發(fā)展[31]。

2.1 以核酸分子雜交為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)

2.1.1 核酸探針技術(shù) 核酸探針技術(shù)以微生物特異性核酸片段為基礎(chǔ)設(shè)計核酸探針，經(jīng)變性、退火和復(fù)性過程使探針能與被檢測核苷酸序列的一段單鏈cDNA或cRNA分子結(jié)合，依據(jù)不同指示劑選用相應(yīng)的方法進行檢測[32]。

2.1.2 肽核酸熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)是由核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展而來，被廣泛應(yīng)用于遺傳學研究中的一項技術(shù)，可以鑒定核酸分子之間的同源性。此技術(shù)對特異性核苷酸片段進行熒光標記，使其作為探針與待檢樣品中的靶基因經(jīng)過堿基互補配對，實現(xiàn)特異性結(jié)合，通過熒光檢測體系對雜交體的檢測實現(xiàn)對樣本中微生物的定性和定量分析[33]。FISH技術(shù)具有特異性強和顯微鏡可視性的特點，在病原微生物診斷、產(chǎn)前診斷和評價微生物群落等方面均有應(yīng)用[34-35]。

由于細胞核糖體含量低、細胞壁通透性差以及存在rRNA的高級結(jié)構(gòu)等多種因素，DNA探針在試驗中常表現(xiàn)出較低的熒光信號，與 DNA探針相比，肽核酸(PNA)具有更高的熱穩(wěn)定性和特異性[36]。近年來，針對一些細菌的特異性序列的PNA探針已被用于益生菌的檢測。Machado等[37]利用PNA-FISH技術(shù)對牛乳中的36株不同乳酸菌屬菌株和20株其他細菌進行了檢測，并測定了探針對各種乳桿菌菌株和其他相關(guān)細菌菌株的特異性和敏感性，試驗表明此方法的靈敏度和特異性分別為100%和95%。此外，F(xiàn)erreira等[38]建立了一種微流控技術(shù)結(jié)合PNA-FISH技術(shù)的釀酒酵母菌快速識別方法，其過程如圖3所示。流經(jīng)微通道的酵母細胞被捕獲后，PNA探針會以恒定的流速與被捕獲的酵母細胞雜交，雜交后用洗滌液去除結(jié)合松散的探針，再用外熒光顯微鏡檢查被熒光標記的酵母細胞。

2.1.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片又稱DNA芯片，能夠進行大規(guī)模高通量篩選，其原理是以已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作為探針，將其有序地固定在支持物上，然后與被標記的樣品DNA進行雜交，通過自動化儀器對雜交信號的強弱進行檢測，定性、定量地對待測樣本中的基因序列進行分析，從而達到檢測樣品中是否含有某種微生物的目的[39-40]。

圖3 微通道中的FISH分析示意圖[38]Figure 3 Schematic illustration of the concept to perform the FISH assay in non-widened pillar-based microchannels

基因芯片技術(shù)已被應(yīng)用于腸道微生物群分析中[41]，在益生菌檢測方面，Patz等[42]通過一種快速的DNA微陣列技術(shù)對植物葉片進行了群落分析，并證明了雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬的存在，試驗表明植物葉片中含有大量潛在的益生菌作用菌屬和菌種，可被視為益生菌的重要來源。Boesten等[43]使用了適于測定尚未完全測序的基因組差異的基于隨機克隆的微陣列方法，構(gòu)建了與人類腸道相關(guān)的6種雙歧桿菌的基因組DNA芯片，并對雙歧桿菌的多樣性和功能性進行了分析。近年來，隨著一些種屬特異性基因不斷被發(fā)現(xiàn)，基因芯片技術(shù)將有更多的靶基因可供選擇，這將大大提高檢測的準確性[44-45]。

2.2 脈沖凝膠電泳技術(shù)

脈沖凝膠電泳技術(shù)(PFGE)是一種分離大分子DNA片段技術(shù)，利用限制性核酸內(nèi)切酶對細菌的全基因組DNA進行消化，產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段，通過脈沖電場方向、電流大小與時間不斷變化，大片段DNA分子在凝膠中被重新定向，從而實現(xiàn)有效分離[46-47]。PFGE技術(shù)具有特異性強和靈敏度高的特點，但是利用PFGE方法鑒定親緣關(guān)系較近的不同種細菌的特異性較差，Yang等[48]從商業(yè)發(fā)酵食品樣品中分離了乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌，并利用PFGE技術(shù)分別對其進行遺傳指紋圖譜分析，結(jié)果從43株乳酸菌中分離出24種PFGE分型，從34株嗜熱鏈球菌中分離出32種PFGE分型，表明所使用的限制性內(nèi)切酶對大多數(shù)菌株都有較好的分型效果，但部分遺傳關(guān)系相近的不同種類的菌株表現(xiàn)出相同的PFGE模式。

2.3 PCR及其衍生技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)可以看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制過程，該方法通過數(shù)十個變性、退火和延伸的循環(huán)使目標核酸序列實現(xiàn)指數(shù)擴增[49]。核酸體外擴增技術(shù)在分子生物學領(lǐng)域被用來定性、定量地分析和檢測微量核酸。近年來，隨著研究的不斷深入，在傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上衍生出一系列新的PCR檢測技術(shù)[50-51]，基于PCR技術(shù)的各種檢測方法已被廣泛用于益生菌尤其是下一代益生菌檢測中。

2.3.1 PCR-DGGE技術(shù) 基于PCR的變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種可將長度相同但序列不同的DNA片段分離的電泳方法，不同組成的DNA雙鏈在含有不同濃度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同，通過變性劑梯度使長度相同但堿基排列不同的DNA片段停在凝膠的不同位置，從而呈現(xiàn)出不同條帶[52]。DGGE法是分析復(fù)雜微生物體系的有效分子工具，被廣泛應(yīng)用于食品菌群結(jié)構(gòu)的分析中，同時被用于分析發(fā)酵食物及腸道中微生物多樣性的研究[53-54]。Nalepa等[55]利用PCR-DGGE方法對16S rRNA基因的高度可變區(qū)進行擴增，從而對原料乳和微生物群進行定性分析，測定了生乳中明串珠菌、短乳桿菌和植物乳桿菌含量；通過對干酪樣品進行檢測，揭示了明串珠菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等細菌的廣泛存在。

2.3.2 實時熒光定量PCR技術(shù) 實時熒光定量PCR檢測(RT-qPCR)是指向反應(yīng)體系中加入熒光基團，在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱變化，實時監(jiān)測特異性產(chǎn)物的量，與傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)相比，其自動化程度更高、動態(tài)范圍更廣[56]。近年來，RT-qPCR技術(shù)已成為試驗中最常用的檢測技術(shù)，在傳統(tǒng)益生菌和下一代益生菌研究中均有所應(yīng)用。Stachelska[57]采用RT-qPCR技術(shù)，對奶酪中的德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行檢測與計數(shù)，結(jié)果表明，該檢測技術(shù)能夠定量檢測10～103CFU/g的產(chǎn)物，且計數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)菌落計數(shù)相比差異不顯著。在下一代益生菌鑒定中，秦倩倩等[58]建立了一種實時熒光定量檢測糞便中阿克曼氏菌的方法，通過選擇特異性高的引物及優(yōu)化退火溫度等實現(xiàn)了阿克曼氏菌的定量檢測，檢出限達102CFU/mL。

2.3.3 PMA-PCR技術(shù) RT-qPCR技術(shù)雖然已被廣泛應(yīng)用于直接定量檢測混合樣品中的微生物，但其并不能區(qū)分活菌與死菌。活細胞和損傷細胞主要是靠細胞膜是否完整來判斷，疊氮溴化丙錠(PMA)作為一種活菌染料，可以滲入受損或死亡的細胞，并在暴露于光下時共價結(jié)合到基因組DNA上，被結(jié)合的DNA無法進行PCR擴增，據(jù)此原理可實現(xiàn)對活菌的定量檢測[59]。PMA-PCR技術(shù)不僅能夠選擇性地檢測目標微生物的活菌數(shù)，而且保留了PCR技術(shù)的高靈敏度和強特異性，成為了檢測樣品中益生菌活菌數(shù)的有利方法[60]。段亮杰等[61]建立了一種PMA-qPCR法，針對發(fā)酵食品中常見的5種乳桿菌設(shè)計特異性引物，并優(yōu)化了PMA處理條件，以增強PMA對死亡細胞或膜損傷細胞細胞膜的滲透性。此外，針對益生菌在凍干和儲存過程中易受低溫的影響使活力降低的問題，Shao等[62]建立了一種適用于保加利亞乳桿菌的PMA-PCR方法，該方法可有效檢測德氏乳桿菌細胞活力，為凍干過程中冷凍保護劑的選擇提供了依據(jù)。

2.3.4 dd PCR技術(shù) 目前PCR技術(shù)已發(fā)展到第3代，即數(shù)字 PCR，液滴式數(shù)字 PCR(dd PCR)是一種比較新的數(shù)字PCR方法，在核酸的精確定量方面具有獨特優(yōu)勢。dd PCR技術(shù)是在進行擴增前，將反應(yīng)體系分成數(shù)萬個液滴，液滴可能不含有待擴增的目標基因，也可能含有1個或數(shù)個待擴增基因片段。經(jīng)循環(huán)擴增后，讀取每個液滴中的熒光信號，有熒光信號為1，無熒光信號為0，最后利用泊松分布的原理及陽性液滴的數(shù)量計算目標DNA的絕對數(shù)量。目前，dd PCR技術(shù)被應(yīng)用于復(fù)雜樣本中微生物準確定量檢測，Gobert等[63]將PMA處理與dd PCR相結(jié)合，對仔豬糞便中的1株鼠李糖乳桿菌和2株副干酪乳桿菌亞種進行定量，揭示了樣本中不同副干酪乳桿菌菌株之間的PMA效率差異。在有害微生物的存在下，PMA-dd PCR技術(shù)可用于少量活細菌細胞的特異性定量，且無需建立標準曲線。

2.4 核酸等溫擴增技術(shù)

PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的核酸體外擴增技術(shù)，但其需要使用熱循環(huán)儀，制約了其應(yīng)用。等溫擴增和PCR的主要區(qū)別在于整個擴增反應(yīng)在恒溫下即可進行，大大簡化了反應(yīng)條件，此外，等溫擴增過程中酶活性不受干擾，因此等溫核酸擴增具有更高的擴增效率和更大的DNA產(chǎn)量[64]。近年來，等溫擴增技術(shù)正逐漸成為替代PCR的最佳微生物檢測方法。等溫擴增技術(shù)的基本原理各不相同，已有10余種不同的等溫擴增技術(shù)被應(yīng)用于微生物檢測中，其中LAMP技術(shù)以其檢測速度快、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點在益生菌檢測中有一定的應(yīng)用，范一靈等[65]針對雙歧桿菌屬細菌16S rDNA基因特異性區(qū)段設(shè)計LAMP引物，根據(jù)反應(yīng)體系的顏色或濁度變化特異性地檢測樣品中雙歧桿菌屬細菌，并在1 h內(nèi)對產(chǎn)品中雙歧桿菌屬細菌進行了定性和初步定量，極大地縮短了檢測時間。近年來不斷涌現(xiàn)了更多更完善的新型等溫擴增技術(shù)，為微生物中益生菌的等溫擴增檢測技術(shù)的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)[66]。

3 總結(jié)與展望

目前，食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中含益生菌的各類產(chǎn)品較多，產(chǎn)品質(zhì)量不一，而活菌的含量和種類與產(chǎn)品的質(zhì)量密不可分，因此，建立一種快速檢測益生菌的技術(shù)是十分必要的。文章介紹的各種檢測技術(shù)各有其優(yōu)缺點，相比之下，等溫擴增技術(shù)的檢測時間短且反應(yīng)簡單，適用于現(xiàn)場的快速檢測，鑒于其高效性、小型化及自動化等優(yōu)勢，等溫核酸擴增技術(shù)將會在微生物檢測方面得到更廣泛的應(yīng)用，發(fā)展前景更為廣闊，但其也存在易產(chǎn)生假陽性和假陰性的缺點，需進一步加強對此技術(shù)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化。

由于遺傳信息的穩(wěn)定性，分子生物學檢測技術(shù)可以提供更為準確的細菌分類鑒定方法，使得分子生物學檢測技術(shù)逐步取代傳統(tǒng)的微生物檢測方法。因此，結(jié)合不同分子生物學技術(shù)的特點，從基因表達水平上對微生物的鑒定與檢測進行研究，尤其是將檢測技術(shù)應(yīng)用于微生物的實地篩查檢測，是后續(xù)相關(guān)研究的主要趨勢。此外，基于免疫反應(yīng)發(fā)展起來的各類檢測技術(shù)具有操作簡便、檢測速度快等優(yōu)點，也是目前檢測技術(shù)研究與開發(fā)中極重要的一方面，在未來的益生菌檢測中具有極大的應(yīng)用潛力。