生物轉化對羅漢果提取物揮發性成分的影響

魏 敏 宋旭艷 - 李 冉 肜 霖 董愛君 - 潘 曦

(湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430040)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是葫蘆科苦瓜屬植物的果實。黃世杰等[1]分析了羅漢果浸膏的香味成分，主要有糠醛、糠醇、5-甲基糠醛、2,4-二羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃-3-酮、5-羥甲基糠醛和反式角鯊烯等。研究表明，酶促反應[2]或者微生物發酵[3-6]可以改善天然香料質量，而且反應條件溫和、專一性強、對環境友好[7]。陳義坤等[8]利用食甲醇芽孢桿菌生物轉化山楂提取物，減少了其刺激性成分，提高了香氣質；羅誠浩等[9]研究食甲醇芽孢桿菌生物轉化當歸提取物，新生成了丁酸、濃馥香蘭素、香蘭素、高香草醇等28種揮發性物質，其香氣更豐富柔和；食甲醇芽孢桿菌還具有生物轉化阿魏酸轉化生產香蘭素的功能[10]。近年來，以丁香酚、異丁香酚和阿魏酸為底物的細菌、真菌生產香蘭素的研究逐漸變為研究熱點[11]。

從香莢蘭植株栽培土壤中篩選的產香菌——植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)[12]，該菌株具有轉化阿魏酸生成天然香蘭素的功能和豐富的酶體系，能利用羅漢果提取物中的阿魏酸[13]、多糖、蛋白質等進行生物轉化，生成香味物質或香味前體物。試驗擬探究產香菌VP4-4生物轉化對羅漢果提取物揮發性成分的影響，以期為羅漢果增香提質及開發利用方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)：CCTCC NO: M 2012005 2012.01.11，該菌從海南香莢蘭植株栽培土壤中分離得到，武漢大學中國典型培養物保藏中心；

麥芽汁、葡萄糖、瓊脂、麥芽糖、蛋白胨：BR級，北京三藥科技開發公司；

二氯甲烷、無水硫酸鈉、95%乙醇、鹽酸、氯化鈉：AR級，國藥集團化學試劑有限公司；

斜面培養基：麥芽汁125 mL，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L；

原始種子培養基：麥芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L；

羅漢果果實：產地為神農架。

1.1.2 儀器與設備

生化培養箱：SHP-080型，上海精宏試驗設備有限公司；

滅菌鍋：YX.350Z型，上海三申醫療器械有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇凈集團安泰公司；

數顯電熱恒溫干燥箱：DM101 A-1型，武漢鼎立烘箱爐業有限公司；

旋轉蒸發器：RE-5IAA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環式真空泵：SHZ-D型，鞏義市予華儀器有限公司；

電熱套：TWCL-T型，鞏義市予華儀器有限公司；

恒溫搖床：HQL 300B型，武漢中科科儀技術發展有限責任公司；

pH計：DELTA-320型，瑞士Mettler Toledo公司；

密度折光儀：DMA4500型，奧地利安東帕有限公司；

電子天平：ALC-210.2型，德國Sartorius公司；

氣相色譜質譜聯用儀：TRACE GC Ultra-DSQⅡ型，美國Thermo Fisher公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅漢果發酵物及其提取物對照的制備

(1) 羅漢果發酵物的制備：用接種環挑取一環植生拉烏爾菌(RaoultellaplanticolaVP4-4)到裝有200 mL液體種子培養基的500 mL三角錐瓶中，35 ℃，120 r/min培養3 d，然后接種到斜面培養基(麥芽汁、葡萄糖、瓊脂)上，在恒溫培養箱中35 ℃靜置培養3 d，挑取一塊斜面菌種，接種到60 mL原始種子培養基(麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉培養基)上，在35 ℃，轉速120 r/min條件下振蕩培養2 d，制得VP4-4種子培養液。

將羅漢果果實粉碎至40目粉末，取50 g粉末裝入圓底燒瓶中，加入25倍質量水混合均勻，裝上冷凝管，電熱套加熱，冷凝回流提取5 h，抽濾，取濾液，115 ℃滅菌20 min，得到羅漢果提取液，作為發酵底物。將VP4-4種子培養液與羅漢果提取液按V種子培養液∶V提取液=1∶5接種，混合均勻，取混合液350 mL置于1 L三角錐瓶中，用0.01 mol/L的HCl溶液調整培養液pH為6.5，恒溫搖床設置溫度35 ℃、轉速120 r/min，發酵72 h，抽濾濃縮得到浸膏，加入3倍質量的體積分數95%乙醇進行醇沉，靜置過夜后抽濾，將濾液減壓濃縮，制得黃褐色浸膏，其相對密度為1.23，為植生拉烏爾菌發酵制備的羅漢果發酵物。

(2) 羅漢果提取物對照的制備：將羅漢果果實粉碎至40目粉末，取50 g裝入圓底燒瓶中并加入25倍質量水混合均勻，裝上冷凝管，電熱套加熱，冷凝回流提取5 h，抽濾，將濾液抽濾濃縮為浸膏，然后加入3倍質量的體積分數95%乙醇進行醇沉，靜置過夜、抽濾，將濾液減壓濃縮得到黃褐色浸膏，其相對密度為1.21，為羅漢果提取物對照。

1.2.2 揮發性成分分析

(1) 同時蒸餾萃取預處理：將植生拉烏爾菌VP4-4發酵的羅漢果發酵物和羅漢果提取物對照分別取5.0 g，裝入1 L圓底燒瓶中，加入400 mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側的圓底燒瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60 ℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現分層后計時萃取5 h。萃取結束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并減壓濃縮至1 mL，濃縮液用于進行GC-MS分析。

(2) 揮發性成分GC-MS分析：HP-5MS(50 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱；進樣溫度250 ℃；分流比20∶1；載氣為He，流速1 mL/min；升溫程序：從50 ℃(1 min)以5 ℃/min升到250 ℃(5 min)；傳輸線溫度250 ℃；EI離子源；電子能量70 eV；掃描范圍為50～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索，采用峰面積歸一化的方法分析，計算每一揮發性組分在產物中的相對百分比含量。

2 結果與分析

2.1 揮發性化學組分分析

GC-MS總離子流譜圖見圖1。經GC-MS分析，通過WILEY和MINILAB譜庫檢索，羅漢果發酵物及其提取物對照共分離鑒定出89種揮發性化學組分，結果見表1。

圖1 羅漢果發酵物和提取物GC-MS總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of Siraitia grosvenorii fermentation and extract by GC-MS

表1 羅漢果發酵物及其對照的揮發性成分及含量?Table 1 Volatile components and contents of Siraitia grosvenorii fermentation and its control

續表1

續表1

由表2可知，羅漢果提取物的揮發性化學成分主要為酸類、酯類、羰基類、烷烴類、 醇類和酚類，相對含量分別為41.20%(6種)，38.07%(15種)，6.15%(13種)，2.81%(1種)，1.14%(5種)，0.54%(2種)。經產香菌植生拉烏爾菌VP4-4生物轉化后的羅漢果發酵物的揮發性化學組分，主要為酸類、酯類、羰基類、烷烴類、醇類和酚類，相對含量分別為60.07%(11種)，30.72%(14種)，4.07%(21種)，0.81%(5種)，0.34%(4種)，0.29%(2種)。與生物轉化前相比，羅漢果發酵物的酸類物質相對含量大幅增加，酯類、羰基類、烷烴類、醇類、酚類相對含量減少。

2.2 揮發性成分種類分析

2.2.1 酸類物質 羅漢果發酵物揮發性成分中，酸類物質含量占比最高，是羅漢果發酵物主要香氣成分或香味前體，對其風味有重要貢獻。經VP4-4生物轉化后的羅漢果發酵物揮發性成分中酸類物質相對含量和種類變化較大，由6種增加到11種，相對含量由41.20%提高至60.07%。選取對羅漢果發酵物中幾種相對含量較高、對風味影響較大的揮發性成分進行詳細分析：棕櫚酸(18.20%)、巖芹酸(17.04%)、十七烷酸(0.21%)，相對含量分別提高至19.67%，22.33%，0.30%；新增的揮發性成分有亞油酸(16.17%)、2-甲基丁酸(0.06%)、己酸(0.16%)和棕櫚油酸(0.76%)；相對含量降低的有肉豆蔻酸(從0.51%降至0.28%)和油酸(從0.83%降至0.21%)。有機酸在卷煙的加香加料過程中添加用以改善卷煙制品的吸味品質[14]，長鏈脂肪酸如棕櫚酸、十七烷酸、亞油酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚油酸等具有調節煙草酸堿度，增加煙氣濃度、甜味、蠟味和豐滿度的功效，并間接影響煙草香氣，在煙氣中起到平衡作用[15-16]；2-甲基丁酸可以增進水果、酒香和乳脂香味，添加到卷煙中使煙氣柔和滋潤，改善辛辣刺激[17]；己酸具有奶酪香氣[18]。

表2 羅漢果發酵物及其對照揮發性成分比例及種類數量

2.2.2 酯類物質 羅漢果發酵物揮發性成分中酯類物質共有14種，新產生了4種，消失了5種，6種含量減少，4種含量變化不明顯。鄰苯二甲酸二異丁酯(從8.15%降至5.33%)和鄰苯二甲酸二丁酯(從22.93%降至19.79%)作為大分子刺激性物質相對含量減少，油酸乙酯(從4.59%降至2.50%)具有花香和果香[19]，亞油酸乙酯(從2.57%降至0.44%)具有降低血液中膽固醇和血脂的作用[20]，棕櫚酸乙酯(從4.86%降至0.40%)呈蜂蠟香、果香[21]，檸檬酸三丁酯(0.13%)有果香味，硬脂酸乙酯(0.09%)可增加卷煙煙氣的甜度，使煙香純正豐滿[22]。酯類物質是由酸和醇在相關酶的催化下經過酯化反應生成的，主要呈果香和花香，對整個羅漢果發酵物香氣的結構和特點產生重要影響。

2.2.3 羰基類物質 羅漢果發酵物揮發性成分中羰基類物質由13種變為21種，總相對含量由6.15%減少至4.07%。主要羰基類香氣成分中4-羥基-4-甲基-2-戊酮(二丙酮醇，從2.81%降至0.85%)有愉快香氣，可能來自于加熱濃縮過程中的美拉德反應[23]，苯乙醛(從0.16%降至0.74%)呈花香、玫瑰花香和蜂蜜香[24]，新產生的香氣成分為5-甲基糠醛(0.14%)，具有持久的焦糖和水果香味，可使香氣豐滿、柔和、清潤、協調、綿長[25]，苯甲醛(0.10%)有苦杏仁味[25]，壬醛(0.07%)具有柑橘香氣[26]，4-羥基-3-甲氧基-苯甲醛(香蘭素0.10%)具有香草及濃郁的奶香[27]，羅漢果原料中含有豐富的阿魏酸，經VP4-4生物轉化阿魏酸產生香蘭素。這些酮類、醛類物質對其整體香氣起到了豐富花香、果甜香及奶香作用。

2.2.4 烷烴類、醇類和酚類物質 烷烴類、醇類和酚類物質相對含量在羅漢果發酵物揮發性成分中占比為1.44%，種類由8種增加為11種，其中糠醇(從0.18%降至0.09%)具有花香味[28]，同時醇類物質也是酯類物質的前體物；新產生的對乙烯基愈瘡木酚(0.08%)具有辛香、木香[29]，在發酵過程中阿魏酸發生非酶脫羧反應得到，也是加熱氧化生成香草醛的前體物[30]。這些物質相對含量較低，但也為羅漢果發酵物提供了花香及香味前體物等修飾作用。

3 結論

通過產香蘭素菌株植生拉烏爾菌RaoultellaplanticolaVP4-4菌株轉化阿魏酸生成天然香蘭素的功能和豐富的酶體系，對羅漢果提取物中的阿魏酸、多糖、蛋白質等進行生物轉化、酯化反應、結合加熱過程中的美拉德增香反應，生成香味物質或香味前體物，通過同時蒸餾萃取和GC-MS技術進行分離鑒定，研究產香菌生物轉化前后揮發性成分的變化。結果表明：經產香菌VP4-4生物轉化后，羅漢果發酵物揮發性成分中化合物種類增多，由羅漢果提取物的50種增加為羅漢果發酵物的64種，其中新產生的揮發性成分有39種，酸類物質含量大幅增加，酯類種類和占比含量稍減少，羰基類、烷烴類的化合物種類增多，占比含量減少；主要香氣成分或香氣前體物為棕櫚酸、巖芹酸、亞麻酸、2-甲基丁酸、己酸、油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、檸檬酸三丁酯、硬脂酸乙酯、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、苯乙醛、5-甲基糠醛、苯甲醛、壬醛、糠醇、對乙烯基愈瘡木酚香蘭素等，這些揮發性組分協同作用，賦予了羅漢果發酵物花香、果甜香、奶香等豐富的天然香氣，減少了大分子刺激性成分的種類和相對含量，起到了增香減雜的作用，對羅漢果的生物產香和生物香料利用開發有一定的指導作用。但發酵香氣成分變化的機理仍需進一步研究。