基于DNA酶催化反應建立適配體比色法檢測雞蛋中氯霉素

程 慧 劉 順 黎 波 黃玉蘭 - 周 濤

(1. 黃梅縣公共檢驗檢測中心，湖北 黃岡 435501；2. 荊州職業技術學院，湖北 荊州 434000；3. 石首市公共檢驗檢測中心，湖北 石首 434400)

氯霉素是一種高效的抑菌性廣譜抗生素，在蛋雞養殖過程中常作為治療抗生素，其在蛋雞體內的消除半衰期較快，但是雞蛋中殘留的氯霉素最快需要12 d才可以完全消除[1-3]。因為氯霉素具有較強的毒性，若長期食用氯霉素殘留的雞蛋會引起機體因正常菌群失調而更易感染疾病。2019年中國農業農村部第250號公告修訂了食品動物中禁止使用的藥品及化合物清單，氯霉素及其鹽、酯類再次明文規定禁止使用，說明食品安全檢測中氯霉素的殘留問題進一步得到重視[4-6]。為滿足食品安全快速檢測和重大活動保障的相關訴求，有必要開發出適合于雞蛋中氯霉素的快速測定，進一步加強市場管理和監督[7-9]。

雞蛋中氯霉素的儀器檢測法為氣相色譜—質譜、液相色譜—質譜/質譜，此方法適合于監管部門對于樣品的周期性檢驗檢測，設備成本和維護成本都較高[10-12]。而目前中國基層檢驗檢測水平能夠實現大型儀器檢測農獸藥殘留較少，即使購買了大型儀器也存在缺少專業技術人員等其他因素導致儀器不能投入使用，若在基層大力推進食品安全快速檢測，可實現大量農副產品的有毒有害物質檢測，將食品安全的風險降至可防可控水平，及時守衛餐桌安全。目前檢測氯霉素的快速檢測方法主要是膠體金免疫分析法，其原理是根據抗體可特異性識別目標分子實現檢測，但雞蛋中農獸藥殘留多為小分子物質，由傳統化學方法得到的目標半抗原后再進行動物試驗，這對于及時應對突發食品安全事件不具有時效性[13-15]。核酸適配體是可在體外進行篩選的一種比抗體更加穩定、高效的人工抗體，目標小分子通常結合于適配體的折疊區域，通過掌握核酸適配體的篩選技術可以快速應對突發事件，能大幅提升基層檢測機構應對食品安全未知風險的能力[16-18]。

近年來研究食品中氯霉素殘留的適配體檢測方法主要有比色檢測法、熒光檢測法、化學發光檢測法和生物傳感檢測法等[19-21]，比色檢測法較其他在可操作性及便捷性等方面更適用于現場快速檢測[22-24]。例如，Yan等[25]基于生物素—鏈霉親和素信號放大測定氯霉素殘留；Huang等[26]基于DNA酶功能化納米探針催化顯色用于快速檢測氯霉素；高慧菊等[27]基于氯化鈀納米顆粒標記聚合物螯合物的雙重信號放大快速檢測氯霉素；Mahbobeh等[28]利用金納米粒子在不同狀態下的顯色反應間接檢測氯霉素殘留量。由此可見，以適配體特異性識別結合顯色反應是目前現場快速檢測的最佳方法，目前適配體比色法通常會利用生物酶、金屬納米粒子實現轉導，在溫育反應和分離洗滌等操作過程中比較繁瑣，易出現假陽性結果，不利于現場快速檢測的有效分析。研究擬將雜交互補鏈反應與顯色反應同時應用于適配體傳感器，建立一種快速檢測氯霉素的新方法，通過引入DNA酶及磁性納米微球實現簡化操作及減少假陽性結果的產生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環素、甲砜霉素：USP級，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

氯化血紅素(貯藏溫度2～8 ℃，hemin)：國藥集團化學試劑有限公司；

羧基磁珠(1.0～2.0 μm，10 mg/mL)：賽默飛世爾科技公司；

DNA酶(1)(5’-GGGTAGGGCGGGTTGGTGGGACAACTCACTGAAGGACATGTA-3)、適配體(2)(5’-NH2-(CH2)6-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)：上海生工生物工程股份有限公司；

紫外可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限公司；

恒溫混勻儀：YN-H02-024型，杭州佑寧儀器有限公司；

16位磁力架：DynaMag-2型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

三重四級桿液相—質譜聯用儀：CN18063026型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 磁珠—適配體的制備

將5 μL 20 mg/mL羧基化磁珠清洗2～3次，按照產品說明進行活化，以實現羧基化磁珠與氨基化適配體的偶聯。向清洗后的磁珠中加入EDC/NHS活化劑(300 μL，2 mg/mL溶于50 mmol/L pH 6.0 MES緩沖液)，置于振蕩器中室溫反應30 min以上。活化反應后用緩沖溶液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)清洗活化后的羧基磁珠，向清洗后的羧基化磁珠中加入氨基化氯霉素適配體(100 μL，3 μmol/L溶于50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)，將上述混合物置于已調至37 ℃的恒溫混勻儀中反應50 min，重復磁珠的清洗操作，再重新分散于300 μL pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，于4 ℃保存。

1.3 檢測條件優化

1.3.1 溫育時間 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(30，40，50，60，70 min)對體系吸光度的影響。

1.3.2 反應時間 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(30，35，40，45，50，55 min)對體系吸光度的影響。

1.3.3 顯色反應 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(5，10，15，20，25 min)對體系吸光度的影響。

1.4 均相反應

向離心管中加入990 μL 10 mmol/L pH為7.5的Tris-HCl(含1 mmol/L EDTA)，進一步向其中加入10 μL 5 μmol/L DNA酶，在恒溫混勻儀中25 ℃震蕩反應45 min后待用。取上述磁珠適配體溶液300 μL與1 mL 0.02 μmol/L DNA酶溶液混勻，37 ℃渦旋混勻反應90 min，磁分離后采用洗滌液和pH 7.0 Tris-HCl溶液交替洗3次，將該磁珠復合物重新分散于200 μL的pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液中4 ℃保存。

1.5 氯霉素的檢測

取30 μL上述磁珠復合物與20 μL按一定濃度梯度配制的氯霉素溶液充分混勻后，在恒溫混勻儀中37 ℃震蕩反應50 min，磁分離后取上清液加入10 μL 1 μmol/L hemin充分混勻后進行顯示反應。先向反應之后的溶液中加入60 μL包含有0.5 mmol/L TMB與0.5 mmol/L H2O2的25 mmol/L pH 5.0檸檬酸鹽緩沖溶液，室溫反應15 min，向反應體系中加入稀硫酸溶液(30 μ/L，2 mol/L)以終止四甲基聯苯的顯色反應。將反應體系靜置10 min后，測定吸光度，并建立吸光度值與氯霉素濃度之間的線性關系。

1.6 氯霉素檢測的特異性

為了驗證方法的特異性，將濃度為100 mg/kg的氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環素、甲砜霉素7種抗生素按照1.4的步驟加入到磁珠復合物中混勻，進行顯色反應后使用分光光度計測量。

1.7 雞蛋樣品的準備

雞蛋樣品購于當地超市。稱取10 g攪拌均勻的樣品于50 mL具塞離心管中，加入1.0 mL 10 ng/mL間硝基氯霉素標準溶液和30 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，4 000 r/min 離心2 min后取上清液轉移至圓底燒瓶中，殘渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液，于35 ℃ 旋轉蒸發至1～2 mL，加入1 mL甲醇溶解提取液，用20 mL 4%氯化鈉溶液和20 mL正己烷液液萃取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中35 ℃旋轉蒸發，用氮氣緩慢吹干備用。

2 結果與分析

2.1 檢測方法原理

試驗擬將模擬過氧化物DNA酶引入雞蛋中氯霉素的適配體傳感器，當氯霉素適配體與磁珠組合體結合后，可與DNA酶發生雜交鏈互補反應，從而使催化活性呈失活狀態。加入不同濃度氯霉素目標分子后，具有高催化活性的DNA酶得到釋放，試驗體系可催化四甲基聯苯胺—雙氧水顯色實現對雞蛋中氯霉素殘留的快速檢測，整個試驗過程原理如圖1所示。當溶液中存在氯霉素時，復合物體系優先與氯霉素結合，使模擬過氧化物DNA酶從復合物體系中解離出進入上清液中。根據加入氯霉素含量的多少確定顏色變化，據此實現雞蛋中氯霉素的定量檢測。

2.2 DNA酶催化顯色反應及磁珠適配體的建立

根據模擬過氧化物DNA酶的催化活性因與目標分子適配體雜交結合后得到抑制的磁珠結合體，可通過改變DNA酶的序列結構使催化活性的抑制效果提高。試驗通過在DNA酶序列的3′末端增加一個A-堿基與未修飾的DNA酶在相同條件下分別與氯霉素磁珠適配體反應，在最優化反應條件下加入100 mg/kg氯霉素標準溶液反應后進行顯色反應。如圖2所示，因氯霉素與DNA酶競爭適配體，導致DNA酶與適配體解離。針對不同試驗階段的雜交反應分別進行驗證分析，DNA酶和適配體(泳道3)與DNA酶(泳道1)、適配體(泳道2)相比電泳遷移速度較慢，證實DNA酶和適配體雜交成功，泳道5與泳道1的重合則充分說明氯霉素與適配體成功結合。從圖3可以看出，未修飾DNA酶a、修飾后的DNA酶b和氯霉素進行的顯色反應相比較，發現以修飾后的DNA酶進行顯色反應引起的吸光度響應效應強于未修飾的DNA酶。

圖1 基于核酸適配體識別引起DNA酶釋放比色分析原理示意圖

為進一步證明氯霉素與適配體的結合，通過紫外—分光光度法驗證適配體與目標物的結合。從圖4可看出，空白的TMB-H2O2溶液無明顯的紫外吸收峰(曲線a)，10 μL 5 μmol/L DNA酶、10 μmol/L hemin、TMB-H2O2溶液及終止液反應后在紫外圖譜上出現了明顯的吸收峰(曲線c)，磁珠適配體溶液300 μL與1 mL DNA酶溶液混勻反應后吸取上清液，加入顯色劑后有較弱的紫外吸收峰(曲線b)，當將100 mg/kg氯霉素用于適配體反應后，所得溶液產物加入顯色劑后也出現明顯紫外吸收峰(曲線d)。這一現象證明了氯霉素加入體系反應之后與適配體結合釋放DNA酶，從而使顯色反應強度進一步提高。

1. DNA酶 2. 適配體 3. DNA酶和適配體 4. 適配體 5. 適配體和氯霉素

圖3 不同物質反應前后吸光度的比較Figure 3 Comparison of absorbance before and afterreaction of different substances

a. TMB-H2O2 b. 空白試劑 c. 100 mg/kg氯霉素 d. DNA酶

2.3 檢測條件優化

2.3.1 溫育時間 由圖5可知，隨著第一次堿基互補配對溫育時間的增加，磁分離之后的溶液在顯色反應之后吸光度響應值逐步降低，說明磁珠上連接的適配體與DNA酶結合后，導致溶液中DNA酶含量減少，顯色反應溶液的吸光度值也隨之趨于減小，當溫育時間>50 min后得到的吸光度值趨于穩定。故以50 min作為最佳反應時間。

2.3.2 反應時間 由圖6可知，將100 mg/kg的氯霉素用于添加DNA酶的磁珠適配體，其吸光度信號響應隨反應時間的增加而增加，說明DNA酶從磁珠適配體上解離的量逐步增加。當氯霉素與反應體系的溫育時間超過45 min時，反應體系的吸光度值趨于穩定。說明氯霉素與添加DNA酶的磁珠適配體反應時間達到45 min時可反應徹底。

圖5 溫育時間對吸收光譜的影響

圖6 反應時間對吸收光譜的影響Figure 6 The effects of reaction times on the absorptionspectral responses obtained

2.3.3 顯色時間 由圖7可知，當顯色反應時間<15 min時，吸光度的響應值隨時間的增加而增加，超過15 min后吸光度的響應值達到穩定。由此可見DNA酶與氯化血紅素的充分反應時間為15 min，此時酶促反應也達到最大限度。因此，以15 min為顯色反應最佳時間。

2.4 線性分析

在優化的條件(DNA酶與適配體的反應時間為50 min，氯霉素加入后的反應時間為45 min，顯色時間為15 min)下，研究不同質量濃度氯霉素在試驗設計方法下的吸光度。比色反應過程中，體系的吸光度值隨氯霉素濃度的增加呈線性增加(見圖8)，線性回歸方程為：y=0.101 1+0.549 5 lgC，相關系數為0.998。

2.5 特異性

分別考察了氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環素、甲砜霉素7種抗生素在該試驗條件下吸光度的響應值。由圖9可知，對目標分析物氯霉素的響應值較大，而在其他6種抗生素的很小。此結果證明該方法對氯霉素具有特異性，其他同系干擾物的交叉響應可忽略。

圖7 顯色反應時間對吸收光譜的影響

圖8 吸收光強度與氯霉素的線性關系

圖9 7種抗生素用于試驗設計的方法后產生的吸收強度響應

2.6 準確性

按照GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》對雞蛋樣品進行適當前處理后，用液相色譜—質譜檢測基底之后，在基底中分別加入質量濃度為5，10，25 mg/kg的氯霉素，得加標樣品，分別用試驗設計的方法、液相色譜—質譜和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法對加標樣品進行檢測，結果見表1。由表1可知，3種方法的RSD分別為2.29%，4.07%，2.59%，回收率為98.4%～101.1%，通過計算3種方法分別所得結果的偏差后得出檢測結果基本一致，將表中所得試驗結果與加標量進行比較得出試驗設計的方法的檢測結果準確度較高。

表1 與標準和常規方法的比較及準確性試驗結果

3 結論

基于適配體—磁珠復合體與氯霉素的競爭反應，以達到解離適配體與DNA酶的雜交結合，成功實現DNA酶與血紅素的催化顯色反應，可用于雞蛋中氯霉素殘留量的快速檢測。結果顯示，該方法對氯霉素的檢測具有檢出限低、選擇性強、反應時間短等優勢，因該方法未涉及較貴重的儀器而且操作簡單易行，較適合基層檢測機構用于現場快速檢測，便于及時篩查出氯霉素殘留超標的樣品。