搭載微混合芯片的食品內亞硝酸鹽含量光電檢測方法研究

龐浩然 - 解加慶 - 關其鋒 - 孟曉宇 - 孫汝千 - 周福陽 -

(西北農林科技大學機械與電子工程學院，陜西 咸陽 712100)

亞硝酸鹽是食品中常見的有害物質，廣泛分布在腌制肉制品和泡菜內。蔬菜中硝酸鹽因為細菌的生長也容易轉化為亞硝酸鹽，成人一次攝入亞硝酸鹽含量>0.2 g即可引起中毒[1]，攝入量>3 g即有致死危險，此外，長期過量攝入亞硝酸鹽還會大幅度增加致癌風險。目前，亞硝酸鹽的檢測方法有分光光度法、催化光度法、催化熒光法、離子色譜法、稱量滴定法、高壓離子色譜法等[2-3]，這些方法普遍存在檢測成本高、預處理時間長、檢測精度低、操作繁瑣或設備龐大等缺陷。

亞硝酸鹽可以使對氨基苯磺酸重氮化，產物遇到鹽酸萘乙二胺時可生成紫紅色偶氮染料。因此，可以配置相應檢測試劑，對食品中亞硝酸鹽進行定性檢測。由于反應生成的紫紅色偶氮染料性質穩定，通過精確檢測反應物顏色變化，也可以實現亞硝酸鹽濃度定量檢測。基于以上原理，李新民等[4]制作了一種基于顏色檢測的亞硝酸鹽傳感器，檢測成本低，但檢測周期設定為1 h，檢測時間長。該傳感器將數據上傳到網絡服務端，更適用于工業檢測領域。Hou等[5]制備了一種基于紙基微流控芯片的亞硝酸鹽檢測儀，將拍攝的反應結果通過WiFi傳輸至自主開發的手機軟件得出試驗結果，實現了檢測結果的遠程輸送，檢測試劑使用減少且提高了檢測精度。但其紙基微流控芯片需通過蠟印技術制備，且只能使用一次，檢測成本較高。Thinikan等[6]基于蜂蠟制備了一種綠色環保的紙基微流控芯片，用于硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測，亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢出限分別為0.1，0.4 mg/L。但該紙基芯片制備前，需先將CTAB與熔化的蜂蠟進行加熱、均質化處理7 min，并冷卻至室溫。處理材料時間過長，不利于紙基微流控芯片的制備。肖良品等[7]制作了一種用于亞硝酸鹽快速檢測的三維紙質微流控芯片，基于紙基芯片的檢測方法簡單便用、穩定性好，但最低檢測濃度還有待進一步降低。此外，檢測結果的獲取需先拍攝圖片再使用軟件分析，結果產生時間較長。綜上，微流控芯片對于快速精準低成本的亞硝酸鹽檢測具有實踐意義，并且紙基微流控芯片具備檢測精度高、檢測試劑少等優勢，但仍存在檢測成本高，檢測預處理時間長等問題。

為實現食品中亞硝酸鹽的高效靈敏快速檢測，試驗擬開發一種便攜式、低成本、高精度的亞硝酸鹽檢測儀，采用高效混合微流控芯片進行進樣混合反應，并利用自主搭建的光電檢測系統測量亞硝酸鹽濃度，為便攜式亞硝酸鹽濃度檢測提供依據。

1 微混合芯片的設計與仿真

1.1 顯色反應原理

亞硝酸鹽含量的檢測是基于格里斯試劑比色法原理[8]，其檢測原理如圖1所示。

圖1 格里斯試劑比色法反應原理Figure 1 Principle of grice reagent colorimetry

1.2 混合微流控芯片設計與仿真

微混合芯片由于通道尺度小，可以大幅度降低檢測樣品的消耗[9]，降低檢測成本。檢測過程中反應溶液混合完全是保證檢測精度和檢測效率的重要前提，而微流控芯片入口處流體的流動屬于層流，且雷諾數極低[10]。因此，為提高芯片的混合效率，通常設計具備縮擴和彎折微通道結構，將層流破壞為湍流，提高雷諾數。基于以上分析，設計混合微流控芯片三維結構(見圖2)。芯片集成了溶液通入、混合、檢測和流出功能，分為2個通道入口、1條混合通道、1個檢測用蓄液池和1個通道出口4部分。通道入口1通入亞硝酸鈉和對氨基苯磺酸的混合溶液，通道入口2通入鹽酸萘乙二胺溶液，在混合通道中進行溶液混合，在蓄液池中完成顯色反應，最終經通道出口流出。為方便封接和實現微量混合，將微流控芯片總尺寸設計為長75 mm，寬25 mm，高2 mm，通道截面尺寸為高500 μm，寬900 μm。此外，在微混合芯片的通道側設計200 μm高的凸臺，以保證芯片封接密閉性。

1. 通道入口 2. 凸臺 3. 混合通道 4. 蓄液池 5. 膠合平面 6. 通道出口

為預測設計的芯片對檢測試劑混合效果的影響，在制備芯片前先采用多場耦合軟件COMSOL對反應液體在芯片通道內的混合過程進行有限元分析，以便預測混合通道對反應液的混合效果。仿真中引入蠕動流和稀物質傳遞耦合場分析，并采取靜態隱式計算方法。流體的質量和動量傳遞機制采取描述不可壓縮流體行為的Navier-Stokes方程進行模擬，其表達式為:

(1)

(2)

式中：

ρ——密度矢量；

ui、uj——流體的速度矢量；

學界好論朱子晚年之論，卻不知象山也有晚年之論。晚年之象山一改中年之學風，內外兼修，再無偏頗之弊。須知晚年象山最大的兩件事，一是要注經立說，二是要處理荊門軍政，此兩者皆側重外王事業，可見其當時的心境與思想已有所轉變。實則晚年陸九淵之學術思想已與朱子無大異，若能哲人多壽，自能會同一致。但以陸九淵晚年之生平與文獻而言，已能見其會同之規模與梗要。

P——流體壓力，N；

τij——應力張量，Pa。

質量通量由擴散和對流給出，其質量平衡方程可表達為:

(3)

式中：

c——反應液體濃度，mol/m3。

顯色反應溶液中溶質的擴散率由擴散系數D決定[11]：

(4)

式中：

K——玻耳茲曼常數；

T——絕對溫度，K；

μ——動態黏度，Pa·s；

r——分子半徑，nm。

在所有參與顯色反應的溶液中，鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸和亞硝酸根的分子量大小分別為259.20，173.19，46.00。其中，鹽酸萘乙二胺分子量最大，由擴散系數D可得其擴散率最低。因此，只要保證鹽酸萘乙二胺在微流道截面內混合完全就可以確定所有參與反應的溶液、溶質在混合芯片通道內得到充分混合。混合指數是指芯片微流道不同截面上混合物擴散濃度最值的標準差，其計算式為[12]：

(5)

式中：

Ci——當前統計截面的鹽酸萘乙二胺最值濃度，mol/L；

N——統計截面的選取濃度數量，mol/L；

由式(5)可知，截面濃度最值差距越小，混合指數越小，混合越均勻。對仿真得到的混合通道內鹽酸萘乙二胺的混合指數進行分析，在混合通道水平截面上建立坐標系并選擇截面，截面沿通道方向間隔2 mm，截面選擇起點為混合通道起點，初始鹽酸萘乙二胺濃度為518.4 mol/L，液體注射速度為1.67×10-5mol/m3。混合芯片內不同位置混合液濃度變化分布規律如圖3所示，微通道截面上混合指數隨微通道位置變化關系如圖4所示，在該流速下混合芯片可以實現對反應液體的高效混合。

2 微流控芯片的制備與封接

為提高芯片的制備效率，降低制備成本，采用光固化3D打印機制備混合微流控芯片[13]。該打印機由平臺、Z軸、材料槽、顯示屏幕和LCD液晶屏幕組成。固化部件在固化過程中附著在平臺上，Z軸控制平臺運動，光敏樹脂放置在材料槽內，光源的入射位置可以通過LCD液晶屏幕控制。為保證芯片的透光度，采用透明光敏樹脂(中國深圳諾華智能科技有限公司)打印制備混合微流控芯片[14]。經調試后，打印機的打印參數如表1所示[15]。

圖3 芯片微通道內鹽酸萘乙二胺濃度分布云圖

圖4 微通道截面上混合指數隨微通道位置變化關系

對打印出的芯片進行測試，將芯片沿通道截面切開，獲取截面形狀尺寸見圖5，其通道寬度為516.8 μm，通道高度為882.1 μm，尺寸誤差為1.29%，滿足使用要求[16]。

使用α-氰基丙烯酸乙酯和75 mm×25 mm的載玻片對打印出的微混合芯片進行封接[17]。將α-氰基丙烯酸乙酯均勻涂抹在芯片表面的膠合平面，并將凸臺和載玻片相互擠壓。在壓力的作用下，凸臺結構與載玻片緊密結合，膠合平面上的α-氰基丙烯酸乙酯呈均勻分布，并且在空氣中微量水蒸氣的催化下發生加聚反應[18]，迅速固化而將被黏物粘牢。膠水和玻璃均具備優良的透光性，可以保證封接后芯片的光學特性。

表1 光固化工藝參數

圖5 截面形狀尺寸Figure 5 Section shape and size

3 光電檢測系統的設計與搭建

采用自行搭建的光電檢測系統對亞硝酸鹽濃度進行定量檢測[19-22]。光電檢測系統包括LED恒定光源6、PVS精密電壓源3、PCS恒流源驅動1和PDV探測器4(見圖6)。為保證檢測精度，系統外殼采取不透光的黑色樹脂制備，整體密封以保證檢測過程中無雜光影響。另外，LED恒定光源、混合微流控芯片蓄液池和PDV探測機探頭位置需穩定處于同一條光路上。

LED恒定光源6由PCS恒定電流源1驅動，由PVS精密電壓源3穩定電壓，恒定光源通過微混合器2的蓄液池，經光線通路5被PDV探測器4探頭接收，并輸出電壓值。亞硝酸鹽濃度對蓄液池中顯色反應的顏色變化深淺有影響，進而影響LED恒定光源輸出至PDV探測器的光照強度，最終影響PDV探測器輸出電壓，根據輸出電壓和檢測亞硝酸鹽濃度的線性關系，可以實現由誘導電壓對亞硝酸鹽的精準檢測。

4 亞硝酸鹽濃度與誘導電壓的對應關系

使用移液槍分別移取1 mL質量濃度為1 g/L的亞硝酸鹽溶液，用等離子水分別稀釋至0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00 mg/L。分別取500 μL亞硝酸鈉溶液與500 μL質量濃度為4 g/L的對氨基苯磺酸溶液混合，將混合溶液與1 000 μL質量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液分別從混合微流控芯片的兩個入口通入，待其在蓄液池中反應3 min后，記錄PDV探測器的輸出電壓值。

1. PCS恒流源驅動 2. 微混合器 3. PVS精密電壓源 4. PDV探測器 5. 光線通路 6. LED恒定光源 7. 藍牙模塊

將亞硝酸鹽濃度和對應的電壓值進行擬合，得回歸曲線表達式為y=4.532 2-0.143 9x，R2為0.996 7。

配置12份質量濃度為1 mg/L的亞硝酸鹽溶液測量該光電檢測儀的檢出限，每次進樣500 μL，所測結果分別為1.02，1.01，1.04，0.99，0.97，1.02，0.98，0.98，1.02，0.97，0.97，1.07，標準差為0.032 0，多次測量平均值為1.003 3 mg/L，檢出限為0.095 7 mg/L，可滿足日常便攜檢測要求[23-24]。

5 實際檢測試驗及數據分析

通過設計泡菜中亞硝酸鹽濃度的檢測試驗，與分光光度法檢測結果進行對比，驗證該亞硝酸鹽光電檢測方法的可行性。

分別配置質量濃度為0.00，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mg/L的亞硝酸鹽標準溶液10 mL，使用分光光度計測量標準顯色液在538 nm處的吸光值，將亞硝酸鹽質量濃度和對應吸光值進行擬合，得線性關系表達式為y=0.410 6x+0.001 4，R2=0.999 5。

吸取5 mL泡菜澄清提取液于比色管中，分別加入2 mL質量濃度為4 g/L的對氨基苯磺酸溶液和質量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液，用蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置10 min。測得吸光值為0.515，經計算比色管中提取液的亞硝酸鹽濃度為0.213 mg/L，泡菜樣本中亞硝酸鹽濃度為2.13 mg/L[25-27]。

取500 μL泡菜澄清提取液與500 μL質量濃度為4 g/L的對氨基苯磺酸溶液混合，將混合溶液與1 000 μL質量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺分別從混合微流控芯片的兩個入口通入，待其在蓄液池中混合3 min后，記錄PDV探測器的輸出電壓值為4.467 V，根據亞硝酸鹽含量與誘導電壓關系曲線得泡菜澄清提取液中亞硝酸鹽質量濃度為0.454 mg/L，泡菜中亞硝酸鹽質量濃度為2.27 mg/L，與分光光度法檢測結果的差值為0.14 mg/L，誤差較小。因此，該搭載微混合芯片的光電檢測儀可用作食品中亞硝酸鹽濃度的定量快速檢測。

6 結論

研究提供了一種搭載微混合芯片的食品中亞硝酸鹽含量便攜式光電檢測方法，對食品中亞硝酸鹽殘留進行高精度的快速檢測。通過光固化技術制備了滿足尺寸要求的高混合效率的微混合芯片，并搭建了相應的光電檢測系統。試驗結果表明，基于微流控芯片的光電檢測系統的最低檢出限為0.095 7 mg/L，最快檢出時間為3 min，可滿足食品中亞硝酸鹽的檢測需求。研究中光電檢測系統的檢測電壓值區間范圍偏小，對檢測精度產生不利影響，后續可對光電檢測系統中的PDV探測器進行改進，以進一步提高探測精度。