慢性乙型肝炎病毒感染和原發性肝細胞肝癌

張 珊 紀 冬 陳國鳳

中國現年齡標準化肝癌發生率為18.3/10萬，病死率為17.1/10萬，其中男性發生率為27.6/10萬，病死率為25.6/10萬，女性發生率為9.0/10萬，病死率為8.6/10萬[1]。原發性肝癌發生率與病死率均高，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占比超過80%，是原發性肝癌中最常見的類型。HCC發生相關的危險因素很多，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相關的肝硬化是其主要誘因。HBV慢性感染與HCC的發生有著非常密切的聯系。

一、乙型肝炎病毒

慢性HBV感染一直是我國高發生率的傳染病之一，最新數據表明，現在我國一般人群乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)流行率為5%～6%，慢性HBV感染患者約7000萬[2]。即使HBV疫苗已被廣泛應用于臨床，其發生率也一直居高不下。HBV侵襲人體的過程與病毒的多方面特性有關。

首先在肝細胞內，HBV中存在的共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV持續感染無法徹底消除的根本原因，只有消滅所有受感染肝細胞的cccDNA，使HBV無法繼續復制，才能獲得疾病完全治愈[3]。cccDNA雖然無法自行復制，但它依靠自身穩定性以及體內多種途徑對cccDNA庫的補充始終維持體內含量的相對平衡，即使接受長期抗病毒治療，也只能使cccDNA含量降低，而不能完全清除[3,4]。作為反映體內病毒情況的重要指標，對cccDNA含量的長期監測很有必要，但cccDNA的檢測方法尚有多方面不足，技術仍需改進。在治療方面，臨床上也逐漸開始應用通過多途徑的以cccDNA為靶點的新型療法，如病毒蛋白負性調控cccDNA、表觀遺傳學修飾、在分子層面上進行基因組編輯等。乙型肝炎的完全治愈未來可期[3,5]。

近年來研究發現，乙型肝炎核心相關抗原(hepatitis B core related antigen，HBcrAg)與cccDNA密切相關，或許可作為替代cccDNA的指標反映體內病毒情況。在體內多個生物指標如HBV DNA及HBsAg等檢測不到或無法檢測時，HBcrAg仍處于較為穩定且可被監測的水平，因此對疾病監測、治療效果評估等起到了良好的作用[6]。另外HBcrAg也被證明是肝癌的獨立危險因素，HBcrAg>10kU/ml的中等HBV DNA載量(2000～19999IU/ml)患者與高HBV DNA載量患者的肝癌危險比比較，差異無統計學意義[7]。

HBV目前已經發現的基因型共10種(A～J)，陸續還有超過30余種基因亞型正在不斷被發現。不同的基因型在地理上和突變體頻率上都存在著差異，跟疾病的發生、治療和預后等關系密切。我國B型與C型病毒是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要誘導因素[8]。

HBV與宿主基因組的整合是HBV致癌的主要原因之一。從肝炎到肝癌，HBV整合數量呈增加態勢且與病毒載量呈正相關，HBV整合靶向基因在許多癌癥相關通路中數量龐大[9]。HBV DNA與宿主細胞DNA的整合往往發生在腫瘤克隆擴增早期，通過引起肝細胞內遺傳物質的改變，降低染色體的穩定性，從而引發一系列細胞信號通路及基因組表達轉錄的異常反應，增加癌癥的發生率[9,10]。通過高通量HBV整合檢測及RNA測序，基因組內共發現4225個整合位點，多為脆弱的基因組位點以及功能性區域，如端粒酶反轉錄酶基因(TERT)、KMT2B和CCNE1等，這些位點均被證明在癌癥發生過程中發揮重要作用[11]。

除此之外，乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在肝癌的發生、轉移等多個環節中均起重要作用。首先HBx蛋白可調節cccDNA的轉錄。HBV感染后，染色體結構維持(structural maintenance of chromosomes，Smc)復合物Smc 5/6與cccDNA結合并靶向其降解，但是由于HBx對Smc 5/6復合物的抑制作用，cccDNA的穩定性得以維持[12]。HBx還可通過激活叉頭框A1(forkhead box A1，FoxA1)因子信號上調雄性特異性致死因子2(male-specific lethal 2，MSL2)，上調的MSL2在肝細胞中泛素化降解載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(apolioprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC)家族成員APOBEC3B，由此達到增加cccDNA穩定性的目的，促使肝癌發生[13]。其次HBV DNA與宿主基因組的整合也對病毒癌蛋白HBx的表達有著重要影響?；蚪M的整合調節癌蛋白HBx的持續表達后不僅使細胞轉錄和增殖控制失調，還增加肝細胞對致癌因子的敏感度[14]。另外還有許多研究發現，多條HBx影響肝癌發生的調節通路，如HBx激活去乙?；?(sirtuin 2，SIRT2)啟動子上調SIRT2，從而增加HBV復制及HBV介導的HCC轉化[15]。HBx通過核轉錄因子NF-κB(nuclear transcription factor-κB)通路促進肝癌細胞生長及轉移等，髓樣特異性蛋白S100A9在其中起到了關鍵性作用[16,17]。

二、宿主因素

慢性HBV患者的感染有多種影響因素，如年齡、性別、肝纖維化及肝硬化程度、糖尿病等。糖尿病最近被證明是肝癌發生的獨立危險因素之一，糖尿病的存在或較高的血糖水平與罹患肝癌和重大慢性肝病的風險較高有關[18]。

近年來研究發現，微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、白介素21(interleukin-21，IL-21)單核苷酸多態性等均為影響HBV感染患者肝癌發生率的重要因素。

蛋白質編碼RNA在分子生物學中一直占據十分重要的地位，然而近年來研究發現，除編碼RNA外，非編碼RNA在癌癥發展過程中的作用不容忽視[19]。非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)可由長度分為200～100000nt的長鏈非編碼RNA以及多種<200nt的短鏈非編碼RNA(small non-coding RNA，sncRNA)。

miRNA是sncRNA中非常重要的一類，miRNA作用的機制是結合在翻譯模板mRNA的3′末端使mRNA沉默，無法參與蛋白質翻譯。對HBV陽性和陰性肝癌患者分別進行miRNA表達譜的測定，共篩選出8個miRNA參與了與HBV無關的HCC，5個miRNA參與了HBV感染，還有7個miRNA在HBV相關HCC中發生了特異性改變。經預測，這些與HBV相關的HCC miRNA可能參與了轉錄，RNA聚合酶Ⅱ啟動子，MAPK信號通路的蛋白質磷酸化，黏著斑和肌動蛋白細胞骨架等方面的調節并作用于AGO2、TP53、CCND1和其他11個對HCC發生和HBV感染有重大影響的基因[20]。

lncRNA在肝癌發生過程中的作用也不容小覷。1例高通量測序研究分析了20例HCC患者的腫瘤血栓和鄰近的正常肝組織中的lncRNA表達，發現了107個與轉移相關的lncRNA失調[21]。另外在一項肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSC)相關研究中發現，通過使用轉錄組微陣列比較CD13+CD133+HCC細胞(定義為LCSC群體)和CD13-CD133-HCC細胞中的lncRNA表達，共鑒定出286個差異表達的lncRNA。除此之外還發現，lncTCF7、lncBRM41和lnc-β-catm42在維持LCSC自我更新中起到了非常重要的作用[22]。lncRNA中的HOTTIP是典型的癌癥相關lncRNA，通過深度測序獲得了HBV-HCC lncRNA圖譜，發現HOTTIP被顯著上調，HOTTIP可顯著抑制HBsAg、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和HBV復制的產生[23]。

IL-21單核苷酸多態性與HBV感染及肝細胞肝癌密切相關。利用PCR-LDR方法檢測發現，IL-21基因的單核苷酸多態位點的不一致性影響著HBV感染及HBV相關的肝細胞肝癌的發生。分別對慢性HBV感染患者、肝細胞肝癌患者及健康對照組進行測序，發現編號為rs2221903的IL-21基因多態序列中，AG基因型相比AA與GG基因型，在慢性HBV感染患者中比例較高，AG基因型是患慢性HBV感染的風險因素。與此相反，rs12508721中TT基因型與CT和CC基因型比較，在慢性HBV感染患者和HBV相關的肝細胞肝癌患者中比例較低，TT基因型是患慢性HBV感染及HBV相關的肝細胞肝癌的保護因素[24]。

由于遺傳多樣性，HBV感染宿主方面的影響因素還有很多值得繼續發掘。

三、抗病毒治療

現有的有效肝癌治療方法包括根治療法(手術切除、消融治療、肝移植)、肝動脈栓塞+化療(TACE)、放射治療、靶向治療及生物治療等，無論采用何種方案，抗病毒都是治療乙肝相關肝癌患者的基礎?？共《局委煵粌H可以降低HCC發生率，還可以減少肝癌復發率。現有的抗病毒療法均以抑制病毒復制為基本原理，缺少徹底清除cccDNA的根治性療法，大多數HBV感染患者需要終身進行抗病毒治療。

替諾福韋與恩替卡韋作為國際公認的抗病毒治療一線藥物在臨床上的應用相當廣泛，已有多項實驗證明，兩種藥物在HBV治療上具有顯著療效，但其在肝癌發生率方面是否存在差異目前仍未完全明確。韓國一項全國性歷史隊列研究對此進行了探索，隊列一的研究對象為2012年1月1日～2014年12月31日開始使用恩替卡韋(n=11464)或富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(n=12692)的慢性乙型肝炎初治患者，數據來自韓國國民健康保險服務數據庫。隊列二作為驗證，納入了2010年1月1日～2016年12月31日接受恩替卡韋(n=1560)或替諾福韋(n=1141)治療的CHB患者的醫院隊列。結果顯示，在人群隊列中，替諾福韋組的HCC年發生率(0.64/100人年)顯著低于恩替卡韋組(1.06/100人年)。通過多變量校正，結果顯示，與恩替卡韋組比較，替諾福韋組的HCC風險和全因病死率或移植率未顯著下降。而對人群和醫院隊列分別進行傾向性匹配后，替諾福韋組顯示出顯著降低的HCC風險。這表明與恩替卡韋治療比較，替諾福韋治療使HCC發生風險在以人群為基礎的成人慢性乙型肝炎患者中顯著降低，該發現在醫院隊列中也得到了驗證。鑒于HCC患者的預后較差，這些發現可能在預防CHB感染患者癌癥發生方面具有重要的臨床意義[25]。這兩種藥物之間的具體差別及臨床應用方法目前仍在討論中，還需要有更多的證據來證明。

抗病毒治療對預防肝癌發生方面的作用毋庸置疑，但HBV感染患者經過長期的抗病毒治療后即便符合臨床治愈標準，也并非意味著病毒在體內完全清除。與未感染HBV者比較，低水平病毒血癥(low-level viremia，LLV)患者在肝癌發生方面的風險仍有升高。一項回顧性隊列研究納入了875例初治HBV單感染患者，給予恩替卡韋單藥治療，患者出現兩類結局，分別是持續病毒學應答(sustained virological response，SVR)與LLV。該項研究對患者的HCC發生風險進行比較發現，無論患者是否患有肝硬化，LLV均與較高的HCC風險相關[26]。

有研究對當HBV DNA水平處于不同基線或腫瘤處在不同階段時，抗病毒治療對早期切除術后的HBV相關肝癌患者的無病生存期(disease-free survival，DFS)和總體生存期(overall survival，OS)的影響進行了討論。結果顯示，高基線HBV DNA水平是所有患者短DFS和OS相關的危險因素。HBVDNA≥2000IU/ml的患者中，抗病毒治療與延長的DFS和OS顯著相關。對于HBV DNA<2000IU/ml或無法檢測的患者，抗病毒治療在延長DFS和OS方面并未顯示出明顯的益處，LLV患者與抗病毒治療之間的關系并未明確[27]。而2020年一項回顧性隊列研究對此做出了回答，研究表明，抗病毒治療可顯著改善LLV患者的OS，但對患者的DFS并無明顯影響[28]。兩項研究的結論說明，高水平HBV DNA與早期肝癌患者預后較差有關。抗病毒治療對所有患者預后均有良好影響，應作為HBV相關HCC患者的常規術后治療。除此之外，另一項大規模隊列研究結果顯示，無論基線病毒水平或腫瘤分期，預防性抗病毒治療均可以顯著改善行介入治療的HBV相關HCC患者的長期生存，其療效與介入治療類型無關[29]。

雖然肝癌的發生與預后與多方面條件都有著不可或缺的關系，但最重要的因素仍是抗病毒治療的進行與否。所以對HBV患者來說，對肝癌的早發現、早診斷以及早治療是獲得良好預后的最為重要的條件。

四、展 望

慢性HBV感染與肝細胞肝癌的高患病率與發生率始終威脅著人們的生命健康。本文從乙肝病毒、宿主以及抗病毒治療3個方向闡述了相關因素對這兩種疾病的影響。乙肝病毒因素方面，cccDNA是乙肝病毒無法徹底消滅的根本原因，因此研究者正以此為靶點研究有效的抗病毒治療方案，以求徹底消滅HBV。除cccDNA外，影響乙肝病毒的因素還包括核心抗原的存在、癌蛋白的表達、HBV基因型以及HBV DNA與宿主基因組的整合等。宿主方面microRNA、lncRNA、IL-21單核苷酸多態性等在近年來一直備受關注?？共《局委煼矫?，一方面以cccDNA為靶點的研究正在進行，另一方面市場上現有的藥物的具體有效性與安全性還未徹底明晰。本文僅對這3個方面影響因素做了分析闡述，未來研究的最新進展應該持續關注。