TRIM 59在結直腸癌中的表達及其與臨床病理指標的關系

高曉斌，武雪亮*，王勝杰，孫光源，王文靜，梁 峰，趙軼峰，劉振顯，張迎春

（河北北方學院附屬第一醫院普通外科，河北 張家口 075000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病亡率分別位于所有腫瘤的第3位和第4位，且發病率呈逐年上升和年輕化趨勢。近年來，隨著我國居民生活方式、飲食結構和生存環境的改變，我國結直腸癌發病率呈持續上升趨勢，2014年我國居民結直腸癌發病例數位居所有腫瘤第3位。盡管結直腸癌的診斷與治療已經取得了長足的進步，但由于在早期篩查、早期診斷上的諸多困難，部分患者失去了最佳治療時期，其整體5年生存率并未明顯提高，較歐美國家仍有較大差距。因此，對它進行深層次的研究，從分子生物學角度闡明結直腸癌的發病機制，尋求敏感度高、特異性強的標志物已成為結直腸癌的研究熱點。三結構域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）是一個結構相對保守的蛋白家族，擁有E3泛素化連接酶活性，在腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等惡性進程中發揮重要作用。目前已有研究發現TRIM59在乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中表達上調并促進腫瘤細胞惡性進展，然而TRIM59的表達水平與結直腸癌的關系目前鮮有報道。因此，本研究擬檢測TRIM59在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，分析其表達與結直腸癌患者臨床病理指標及預后的相關性，旨在為結直腸癌診斷、分子治療的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年2月—2016年2月河北北方學院附屬第一醫院普通外科收治的86例結直腸癌患者的臨床資料，選取癌組織和相應的癌旁正常組織手術切除標本。86例結直腸癌患者中，男47例，女39例；年齡40～79歲，中位年齡64歲，小于65歲的38例；直腸癌45例，結腸癌41例。所有納入患者臨床資料均完整，本研究經河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會批準通過，所有研究對象均簽署知情同意書。病例納入標準：①行CRC根治性手術并且術后病理明確診斷為結直腸癌；②臨床資料完整，術后留存組織學標本。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤者；②臨床資料不全或難以配合取材者；③伴有嚴重心、肝、腎功能異常者；④新輔助放化療患者。術后隨訪主要通過門診復診、電話及網絡等方式對所有患者進行隨訪調查，隨訪時間為60個月，了解患者術后死亡時間及原因，所有納入研究的患者均獲得隨訪數據。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑

TRIzol提取試劑購于Sigma公司；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生物工程技術公司設計并合成；TRIM59多克隆抗體購自美國Abcam公司；SP法免疫組化試劑盒、蘇木素染料及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測TRIM59 mRNA表達

使用總RNA提取試劑抽提組織中的總RNA，測定總RNA濃度。根據反轉錄試劑盒兩步法合成cDNA，反應體系按說明書要求配制，然后進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）擴增。引物序列如下：TRIM59上游5′-ATGGCCGATGACGTAATC GCG-3′，下游5′-CGTGAGCTCACCATGGATCAG-3′；GAPDH上游5′-TCCCTCGTGCTAGATCATGAA-3′，下游5′-GGTCATGATCAGCCACTGTC-3′。PCR反應條件為：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、35 s，72℃、30 s，進行35個循環；于72℃延伸7 min。mRNA表達量采用2計算。

1.2.3 免疫組織化學法檢測TRIM59蛋白表達

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidinperosidase，SP）法檢測TRIM59蛋白的表達水平。石蠟塊使用二甲苯脫蠟，作3.5μm厚的連續切片，80℃烤箱烘烤30 min，脫水；抗原熱修復，3%過氧化氫孵育，血清封閉；滴加兔抗人TRIM59多克隆一抗孵育過夜；加入生物素標記二抗孵育1 h。最后使用DAB顯色30 s，蘇木精復染，松節油透明和樹膠行封片處理，最后置于光鏡下觀察。

免疫組化的結果判讀是由兩名病理科醫師進行雙盲讀片，根據陽性細胞比例評分與細胞染色強度分值乘積進行半定量分析，鏡下隨機選取5個高倍鏡視野（×400），每個視野計數100個腫瘤細胞。陽性細胞染色強度評分：無細胞染色為0分，淺黃色顆粒為1分，黃色顆粒為2分，褐色顆粒為3分。陽性細胞所占比例評分：陽性細胞數≤10%為0分，10%～25%（含）為1分，25%～50%（含）為2分，＞50%為3分。陽性細胞染色強度評分和比例評分的乘積≥4分判定為高表達，＜4分判定為低表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0進行統計學分析，采用GraphPad Prism 7軟件作圖，用均數±標準差表示計量資料，組間比較采用配對樣本

t

檢驗；用百分率（%）表示計數資料，采用

χ

檢驗。采用Kaplan-Meier分析和Log-rank法檢驗結直腸癌患者TRIM59表達水平與預后的關系，

P

＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM59 mRNA和蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的表達

采用qPCR檢測配對的結直腸癌及癌旁組織中的TRIM59 mRNA表達水平，結果表明，TRIM59在結直腸癌組織中表達水平較配對的癌旁組織明顯升高，差異有統計學意義（

t

=12.86，

P

＜0.01），其中25對配對樣本的表達情況見圖1。免疫組化檢測結果表明，TRIM59蛋白主要定位于腫瘤細胞質和細胞核內，染色呈棕黃色和黃褐色，而在癌旁組織中不表達或在正常黏膜細胞胞質內呈弱陽性表達，見圖2。TRIM59蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率為62.79%（54/86），在癌旁組織中的陽性表達率為32%（37/86），兩組比較差異有統計學意義（

χ

=6.74，

P

＜0.01）。

圖1 TRIM59 mRNA在結直腸癌及癌旁組織中的表達

圖2 免疫組化檢測TRIM59蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的表達（SP，×200）

2.2 TRIM59蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理指標的關系

TRIM59蛋白表達水平與結直腸癌臨床病理指標的相關性分析結果見表1。結直腸癌組織中TRIM59蛋白表達水平與結直腸癌患者的TNM分期（

χ

=8.515，

P

=0.003）、腫瘤浸潤深度（

χ

=7.167，

P

=0.007）以及淋巴結轉移情況（

χ

=5.511，

P

=0.018）相關，而其與患者的性別、年齡、遠處轉移及腫瘤分化程度均無顯著相關關系（

P

＞0.05）。

表1 TRIM59蛋白表達水平與結直腸癌患者臨床病理指標的相關性

2.3 TRIM59蛋白表達與結直腸癌患者生存期的關系

通過Kaplan-Meier分析TRIM59蛋白表達與結直腸癌預后的關系，結果見圖3。可見TRIM59高表達組患者的總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS）較TRIM59低表達患者顯著縮短（

P

＜0.01或0.05），即TRIM59蛋白表達水平越高，結直腸癌患者預后越差。

圖3 TRIM59蛋白表達與結直腸癌患者術后預后的相關性分析

3 討論

TRIM59屬于TRIM蛋白超家族成員之一，其編碼基因位于人類第3號染色體上。TRIM59結構包含高度保守的RBCC三段結構域和涉及蛋白跨膜定位的TM結構域，其主要功能是參與調控TRIM59細胞內定位。TRIM59主要位于細胞內質網膜上，通過介導蛋白與蛋白間的相互作用，調控蛋白穩定性，進而促進腫瘤細胞的無序化增殖，促進腫瘤發生。較多研究表明，TRIM59在多種實體腫瘤中充當癌基因，在惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等過程中發揮重要作用。最近研究報道，TRIM59在食管癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中表達上調，并且可通過多種信號通路或途徑參與腫瘤的惡性進展。因此，進一步提高對

TRIM59

基因研究的認識，有望為腫瘤早期診斷和治療提供新靶點。

研究報道，TRIM59在非小細胞肺癌中的表達明顯上調，其表達與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙狀態、腫瘤分期、淋巴結轉移和病理分期密切性相關。此外，Cox回歸分析結果表明TRIM59是NSCLC的獨立預后因子。以上表明TRIM59可作為非小細胞肺癌預后的獨立預測指標和潛在的治療靶點。

有學者研究發現，TRIM59在胰腺癌組織中的表達顯著增加，并且其高表達與胰腺癌患者不良預后呈正相關。進一步研究發現，TRIM59可能通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路增強腫瘤細胞的糖酵解，從而促進腫瘤細胞增殖和遷移，進而促進腫瘤進展。Zhou等采用qPCR和Western blot法檢測50例胃癌組織和配對胃正常組織中TRIM59 mRNA和蛋白水平，結果表明，胃癌組織中TRIM59 mRNA和蛋白水平較癌旁組織明顯升高，且其高表達與胃癌患者生存時間縮短相關。體外實驗表明，干擾

TRIM59

基因表達后，胃癌細胞系的增殖、克隆形成和遷移能力明顯降低，而過表達TRIM59則反之。TRIM59與p53發生物理作用，增加其泛素化和降解。機制研究表明TRIM59可能通過促進p53的泛素化和降解，進而促進胃癌細胞的增殖和生長。本研究首先采用qPCR技術檢測結直腸癌組織及配對的癌旁組織中TRIM59 mRNA表達水平，結果表明，與癌旁組織相比，TRIM59 mRNA在結直腸癌組織中顯著高表達。同時，本研究的免疫組化檢測結果發現，TRIM59在結直腸癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織。這些結果提示

TRIM59

可能是一個原癌基因，其與結直腸癌的發生與發展密切相關。進一步分析發現，結直腸癌組織中TRIM59蛋白的表達與患者的TNM分期、腫瘤浸潤深度以及淋巴結轉移密切相關，生存分析表明TRIM59高表達組患者的OS和DFS明顯短于低表達組患者，說明TRIM59與結直腸癌的發生發展密切相關，TRIM59高表達提示結直腸癌高侵襲性及不良預后。結合上述結果表明，TRIM59在結直腸癌的發生發展過程中扮演重要的角色，其在結直腸癌中高表達提示患者不良預后，可能對結直腸癌的臨床診療及預后評估具有一定的參考價值。

總之，本研究發現TRIM59在結直腸癌組織中高表達，并與腫瘤惡性程度和不良預后密切相關，為深入研究結直腸癌的分子標志物以及治療靶標提供新思路，但本研究僅從mRNA和蛋白水平分析了TRIM59與結直腸癌的臨床相關性，TRIM59參與結直腸癌的惡性進展的具體作用分子機制仍需進一步探討。