云南省江城縣小反芻獸疫的血清學(xué)及分子流行病學(xué)調(diào)查

付 偲，李東鵬

（江城縣動物疫病預(yù)防控制中心 665000）

小反芻獸疫也被稱作羊瘟，屬于接觸性、急性傳染病，疫病特征有發(fā)熱、壞死性口腔炎、鼻部與眼部有膿/漿液性分泌物、支氣管肺炎、胃腸炎等，此病發(fā)作后期會由于動物繼發(fā)寄生蟲或細(xì)菌感染等引起死亡，且死亡率非常高，容易給養(yǎng)殖人員帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。小反芻獸疫病原是副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒，包含顯著的上皮組織嗜性與淋巴組織。小反芻獸疫病毒粒子主要成分有大蛋白、磷蛋白和核衣殼蛋白等，整體呈圓形。病毒有四個基因系，而血清型只有一個[1]。此病毒主要會感染綿羊、山羊，其病理變化以及臨床癥狀類似于牛瘟，抗原性接近于RPV，具備血清學(xué)交叉保護(hù)功能，可造成牛不排毒、無癥狀的自然感染。在小反芻獸疫防疫中，主要可通過牛瘟病毒疫苗預(yù)防此疫病，因此很多地區(qū)與國家不關(guān)注進(jìn)一步研究與防控小反芻獸疫，同時因為小反芻獸疫病毒會不斷變異，牛瘟病毒疫苗難以持續(xù)發(fā)揮交叉保護(hù)作用，使得小反芻獸疫在亞洲、非洲多個區(qū)域快速擴(kuò)散。我國的小反芻獸疫疫情主要從西向東不斷擴(kuò)散，云南發(fā)病數(shù)量最多。小反芻獸疫病毒一般只繁殖于細(xì)胞中，對自然環(huán)境不具備很強(qiáng)抵抗力，且對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫都有較高敏感度。一般在50℃環(huán)境中，只需1h即可殺滅病毒，同時在pH值小于4.0或者大于11.0條件下也會失活，不過該病毒耐低溫，可長期存活于冷凍、冷藏組織中[2]。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1待試樣本

試驗中血清樣本以及羊眼拭子分別采集于2018年、2019年、2020年云南省江城縣26個規(guī)模養(yǎng)殖場和38個散養(yǎng)戶，包含707份血清樣本和100份羊眼拭子樣本。采集全血后1500r/min離心5min獲取血清，羊眼拭子加入適量生理鹽水，將處理好的樣本保存在-20℃環(huán)境中，以供備用。

1.1.2 試劑與儀器

（1）核酸提取試劑盒: 西安天隆科技有限公司， 批號20091710T015；（2）小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒: 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，批號201811-20100、020171901、020171905、020172005；（3）反應(yīng)體系試劑盒: One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit，寶生物（大連）有限公司，批號AIG0899A；（4）核酸提取儀: 西安天隆科技有限公司，型號NP968-C；（5）熒光PCR儀: 美國 BIO-RAD公司，型號:CFX-96 ；（6）酶標(biāo)儀: 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號MUItiskanFc。

1.2 試驗方法

1.2.1 以ELISA檢測血清抗體

根據(jù)ELISA抗體檢測試劑盒的說明書開展血清抗體測定工作，OD值主要通過酶標(biāo)儀讀取，進(jìn)而對血清阻斷率（PB）數(shù)值進(jìn)行科學(xué)計算。PB=100-（樣本血清OD值/酶標(biāo)抗體平均OD值）×100%。若PB值＞50，結(jié)果為陽性；若PB值≤50，結(jié)果為陰性。

1.2.2 以RT-qPCR檢測病原

1.2.1.1 提取RNA

將羊眼拭子從冰箱取出回到室溫，然后在震蕩器上充分混勻，根據(jù)說明書要求提取RNA，放在-80℃環(huán)境中凍存以備用，或者馬上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.1.2 RT-qPCR擴(kuò)增

根據(jù)說明書配置反應(yīng)體系，其中2xOne Step RT-PCR BufferⅢ（10uL）、TakaRa Ex Taq Hs（0.4uL）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ（0.4uL）、上引物（0.5uL）、下引物（0.5uL）、引物探針（0.5uL）、RNase Free dH2O（8uL）、模板（2uL）。反應(yīng)條件: 42℃30min；95℃ 10min；95℃ 15S，共55個循環(huán)；60℃ 1min。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物展開瓊脂糖凝膠電泳（10g/L），利用凝膠成像系統(tǒng)觀察[3]。

2 試驗結(jié)果

2.1 不同年度的小反芻ELISA免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

于2018年、2019年、2020年從云南省江城縣26個規(guī)模養(yǎng)殖場和38個散養(yǎng)戶中采集707份血清樣本展開ELISA免疫抗體監(jiān)測，得出2018年當(dāng)?shù)匦》雌c獸疫抗體合格率是76.19%，2019年合格率是77.14%，2020年合格率是82.27%，總合格率是78.22%。具體見表1。

表1 2018～2020年云南省江城縣小反芻獸疫ELISA免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

2.2 不同養(yǎng)殖類型的小反芻ELISA免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

當(dāng)前該地區(qū)既有規(guī)模養(yǎng)殖類型，也有散養(yǎng)類型，但整體畜禽養(yǎng)殖規(guī)模化程度較低，多以農(nóng)村散養(yǎng)為主。通過分析2018～2020年監(jiān)測數(shù)據(jù)，可發(fā)現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖場以及散養(yǎng)戶其小反芻獸疫免疫抗體整體合格率分別是74.22%、80.95%，兩者相比散養(yǎng)戶合格率更高，原因可能與當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場數(shù)量較少有關(guān)。詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 2018～2020年云南省江城縣不同養(yǎng)殖類型的小反芻獸疫ELISA免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

2.3 不同年度的小反芻獸疫RT-qPCR病原檢測結(jié)果

于2020年在云南省江城縣隨機(jī)采集100份羊眼拭子進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，表示當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖羊沒有感染小反芻獸疫病毒。

3 討論分析

小反芻獸疫屬于一種具有很強(qiáng)傳染性的疾病，是小反芻獸疫病毒所引發(fā)的，具有很高的感染率，且動物感染后期常會因繼發(fā)寄生蟲感染或細(xì)菌感染出現(xiàn)死亡，整體死亡率非常高，當(dāng)前世界動物衛(wèi)生組織要求一旦發(fā)現(xiàn)此病都要及時上報[4]。通過2018～2020年的系統(tǒng)性監(jiān)測調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)匦》雌c獸疫免疫抗體平均合格率為78.22%，達(dá)到我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求，且檢測中未發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫病毒，證明此地區(qū)還未受到小反芻獸疫病毒感染，當(dāng)?shù)亻_展的小反芻獸疫免疫以及相關(guān)防控工作較為有效，并且疫苗免疫措施對養(yǎng)殖動物產(chǎn)生良好保護(hù)作用。但總體來說，免疫抗體合格率水平并不算高，需要小反芻獸疫免疫工作加大工作反思，找到免疫漏洞，努力提升免疫合格率。

通過對不同年度以及不同養(yǎng)殖類型的養(yǎng)殖戶展開小反芻獸疫ELISA免疫抗體監(jiān)測，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)從2018年至2020年免疫抗體合格率呈逐年上升趨勢，且散養(yǎng)戶免疫抗體合格率普遍比規(guī)模場養(yǎng)殖戶合格率高。通過分析，總結(jié)出以下幾點(diǎn)原因: ①云南省江城縣7個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）多處于山區(qū)半山區(qū)，村落分布較散，畜禽養(yǎng)殖規(guī)模化程度較低，多以農(nóng)村散養(yǎng)為主，所以規(guī)模養(yǎng)殖場缺乏養(yǎng)殖經(jīng)驗，飼養(yǎng)管理制度尚不完善，對免疫工作缺乏足夠重視度。而因為當(dāng)?shù)厣B(yǎng)戶較多，受到疫病防控人員的高度關(guān)注，日常對散養(yǎng)戶會進(jìn)行較多宣傳與教育，使其更重視疫病免疫工作；②部分免疫人員在對疫苗作出稀釋操作后沒有及時免疫，在氣溫較高環(huán)境中沒有嚴(yán)格按照要求冷藏保存，進(jìn)而直接影響免疫效果；③該縣地處中、老、越三國交界處，國境線長達(dá)158.742km，有4個邊境鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）與老撾越南接壤，邊境一線沒有天然屏障，民間通道較多，邊民長期共同放牧，交往頻繁，影響動物疫病防控效果；④近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，牧民們有更多途徑和渠道增加收入，相比之下養(yǎng)殖收入普遍不高，影響牧民養(yǎng)殖積極性，對畜禽免疫工作缺乏關(guān)注度，不注重動態(tài)跟蹤免疫效果，出現(xiàn)免疫效果不佳或漏免情況也不及時補(bǔ)免[5]。

經(jīng)過此次對云南省江城縣地區(qū)展開小反芻獸疫的血清學(xué)及分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)匦》雌c獸疫免疫防控工作依舊有較大提升空間，日常工作中不僅要做好飼養(yǎng)管理和免疫工作，還要對畜禽加強(qiáng)檢疫，留種畜禽必須為沒有感染小反芻獸疫病毒且免疫抗體合格的動物。同時，要對邊民共同放牧情況加大控制力度，做好疫病控制宣傳教育，在引入外部動物過程中需嚴(yán)格落實隔離觀察政策，從根本上避免病原傳入本地。