基于游離氨基酸、揮發性組分和感官評價的2 種酸化技術加工乳餅的滋味特征差異分析

魏光強，李子怡，黃艾祥,*，萬長江

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.大理農林職業技術學院，云南 大理 671003）

乳餅是滇中彝族、路南撒尼族地區的一種傳統酸凝新鮮干酪，其歷史悠久，風味獨特，傳統的直接酸化乳餅是通過向原料乳中添加自然發酵的酸乳清或酸醋，以及酸木瓜、奶漿藤的浸提液，在高溫條件下（85～90 ℃）酸促凝乳，排乳清，然后在模具里壓制成型制得[1]。乳酸菌在酸乳制品中起著主要作用，乳酸菌發酵可產生有機酸、呈味氨基酸、呈味肽等滋味物質，以及脂肪酸類、醇、醛、酯、酮等揮發性風味物質，從而改善發酵乳制品風味。前期研究通過添加乳酸菌發酵酸化，再輔助加熱凝乳，研發了一種發酵型乳餅的加工工藝。

干酪的滋味主要源于蛋白質和脂肪的降解[2-3]，其中提供基本滋味的物質主要有氯化鈉（提供咸味）、乳酸（提供酸味）、游離氨基酸和游離脂肪酸（提供甜、鮮、苦等多種滋味）等[4]，滋味物質也是風味物質的前體物，可進一步分解為揮發性風味物質，對干酪的風味具有重要作用[5]。Toelstede等[6]分別對成熟4 周和44 周的Gouda奶酪中的49 種滋味活性物質和礦物質鹽進行全面定量測定，叢艷君等[7]運用電子舌技術對不同時間超聲處理的奶酪滋味進行區分，馬楊等[8]研究了新疆特色酸凝奶酪成熟過程中非揮發性風味物質（有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸）的變化；馬艷麗等[9]利用固相微萃取-氣相色譜-質譜檢測了乳餅中的揮發性風味物質。部分學者將組學技術應用于奶酪制品[10-11]和發酵乳制品[12-13]的風味特征分析中，該技術將感官與風味成分結合分析相應風味物質貢獻的特征感官風味，并分析二者的相關性。目前，對乳餅的研究主要集中在加工工藝[14]、成分分析[15]以及乳酸菌的分離鑒定[16]等，對乳餅中的非揮發性風味物質研究較少，乳餅的特征滋味物質尚不明確。

本研究采用氨基酸分析儀和氣相色譜儀對傳統酸水直接酸化乳餅和發酵型酸化乳餅的主要特征呈味物質（游離氨基酸、游離脂肪酸）進行定量測定，采用滋味活度值（taste activity value，TAV）判定特征呈味物質；采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法和偏最小二乘（partial least squares，PLS）法分析乳餅中的特征呈味物質與感官屬性之間的相關性，確定對每個感官屬性有顯著性貢獻的呈味物質，旨在揭示不同加工工藝對乳餅中主要特征呈味物質的影響，為乳餅工藝的改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷斯坦牛奶：由云南德摩菲爾生物科技有限公司提供，其主要成分含量為蛋白質3.1%、脂肪3.4%、總固體含量11.84%、乳糖4.88%，酸度13.38 °T。

自然發酵酸乳清：加工乳扇、乳餅剩余的乳清裝于密閉的玻璃罐中，在自然條件下發酵15～20 d而成，pH值在3.0～3.2之間。

實驗菌株：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）為CICC菌株；羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）由用于生產乳扇、乳餅的酸乳清中分離鑒定，4 株菌活化至活菌數大于108CFU/mL時按體積比1∶1∶2∶2復配，菌液經離心后除去上清液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入凍干保護劑后進行冷凍干燥制得直投式發酵劑（活力為2.6×107CFU/g）。

三氯乙酸（分析純） 天津市風船化學試劑有限公司；正己烷、甲醇（均為色譜純） 德國默克股份有限公司；檸檬酸、葡萄糖、咖啡堿、氯化鈉、谷氨酸鈉、丁酸、乙醇（均為食品級） 河南萬邦化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SVJ-358智能商用型酸奶機 北京世紀陽光公司；SW-CJ-IF單人雙面超凈無菌操作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；30氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 乳餅樣品的制備

傳統酸水乳餅（直接酸化技術）加工工藝：新鮮牛奶→殺菌（85 ℃、15 min）→添加自然發酵酸乳清（按牛奶∶酸乳清=6∶1（V/V）比例添加酸乳清）→調整pH值至4.8→凝乳（85～90 ℃，5 min）→形成凝乳顆粒→過濾→壓制成型→傳統酸水乳餅。

發酵型乳餅（發酵酸化技術）加工工藝：新鮮牛奶→殺菌（85 ℃、15 min）→冷卻（38～42 ℃）→接種發酵劑（質量分數0.2%～0.3%）→發酵（42 ℃，發酵至終點pH值為4.9）→升溫凝乳（65 ℃、30 min）→形成凝乳塊→過濾→壓制成型→發酵型乳餅。

按照上述工藝分別制得傳統酸水乳餅樣品3 份（記為SS1、SS2、SS3）和發酵型乳餅樣品3 份（記為FJ1、FJ2、FJ3），置于4 ℃冰箱保藏7 d，備用。

1.3.2 感官評價

釆用定量描述性感官評價方法[17-18]，選取10 點制，0～3 分（弱）；4～7 分（中等）；8～10 分（強）。評定小組由10 人組成，6 男4 女，年齡在21～30 歲之間，酸、甜、苦、咸、鮮和異味6 種基本味道分別選取檸檬酸、葡萄糖、咖啡因、氯化鈉、谷氨酸鈉、10%丁酸+8%乙醇作參照物，參照物質量濃度如表1所示[19-22]。在室溫環境下稱取20 g乳餅置于潔凈的培養皿中，切成2 cm×1 cm×1 cm的小塊，采用3 位數字隨機編碼的方式呈遞樣品進行滋味感官評價。

表1 感官評價Table 1 Criteria for sensory evaluation of milk cakes

1.3.3 游離氨基酸含量測定

根據GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》采用氨基酸自動分析儀檢測。準確稱取粉碎的乳餅1.00 g，用5 g/100 mL的三氯乙酸溶液定容至25.0 mL，搖勻，靜置1 h后，采用雙層濾紙過濾，所得濾液于10 000 r/min離心10 min，取上清液至進樣瓶中，用全自動氨基酸分析儀上樣分析。

1.3.4 游離脂肪酸含量測定

根據GB 5413.27—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》的乙酰氯-甲醇甲酯化法經氣相色譜儀分離檢測游離脂肪酸。采用羅茲-哥特里法提取樣品的粗脂肪，準確稱取粗脂肪0.05～0.10 g于螺帽小玻璃瓶中，加入0.5 mL正己烷和1 mL 10%的HCl-甲醇溶液，振蕩混勻后進行甲酯化，60 ℃水浴3 h并每隔30 min振蕩一次。甲酯化結束后，再加入1 mL飽和NaCl、1 mL正己烷，3 000 r/min離心3 min，將上清液轉移至小管中。向原體系中再加入1 mL飽和NaCl、1 mL正己烷，3 000 r/min離心3 min再次提取。將2 次提取得到的溶液混合，用氮氣吹干，加入1 mL正己烷溶解，取0.5～1 mL樣液于進樣小瓶中，氣相色譜檢測。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；氫火焰離子檢測器。進樣口溫度240 ℃，采用分流進樣，分流比為15∶1，載氣流量2 mL/min。程序升溫：120 ℃維持3 min，按5 ℃/min升至190 ℃，按1 ℃/min升溫至210 ℃，并保持3 min。

脂肪酸甲酯混合標準液用正己烷稀釋成不同濃度梯度，峰面積采用外標法進行定量分析。

1.3.5 特征呈味物質的篩選

參考Warmke等[23]的方法，利用TAV評價各呈味物質對乳餅滋味的影響。TAV按下式計算：

1.4 數據處理與分析

采SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著；P＜0.001，差異極顯著；采用Origin 2019b軟件進行圖表繪制以及對感官數據的PCA；使用SIMCA軟件（V15.0.2）進行PLS相關性分析。

2 結果與分析

2.1 感官分析

2.1.1 感官評價結果

如圖1所示，單因素方差分析結果顯示，2 種工藝加工乳餅的酸味、甜味、苦味、鮮味和異味存在極顯著差異（P＜0.001），總體滋味強度差異顯著（P＜0.05），而咸味差異不顯著，咸味主要由氯化鈉、磷酸鈉和精氨酸引起[4]，乳餅作為國內的傳統酸凝奶酪，加工過程無需添加氯化鈉，故咸味較弱[14]。傳統酸水乳餅的異味較重，原因是加工過程通過添加自然發酵的酸乳清直接酸化制作乳餅，從而把酸乳清中的霉味、腐敗味和乙醇味帶到了乳餅中，導致乳餅中存在不潔氣味，此研究與馬艷麗等[9]的研究結果一致。發酵型乳餅的甜味、苦味、鮮味以及酸味較高，原因是發酵型乳餅加工過程中乳酸菌發酵，分解蛋白和脂肪產生更多的游離氨基酸和游離脂肪酸等呈味物質。綜上，乳餅的滋味特征以鮮味為主[7]，傳統工藝加工的乳餅甜、鮮和苦味較為融洽，但存在腐敗味等不良氣味，而發酵型乳餅的甜味、鮮味、苦味及酸味強度得以提升，不愉悅的滋味有所降低。

圖1 乳餅的感官評分雷達圖Fig.1 Radar chart of sensory scores of milk cakes

2.1.2 乳餅樣品與感官屬性的PCA

采用Origin 2019b軟件對傳統酸水乳餅和發酵型乳餅的滋味感官評分進行PCA，如表2及圖2所示。前3 個因子的特征值之和占總特征值的98.70%，能夠解釋原變量的大部分信息。PC1重點反映了酸味、甜味、苦味、鮮味4 個指標的變異信息，且都處于PC1軸的正方向，特征向量值均大于0.37，這表明總體滋味強度與酸味、甜味、苦味、鮮味呈主要正相關，與咸味和異味呈負相關；PC2重點反映了咸味、異味等不良滋味的變異信息；PC3與酸味指標呈正相關，與苦味指標呈負相關。由圖2可知，傳統酸水乳餅和發酵型乳餅在距離上有明顯區分；發酵型乳餅的滋味特征比較豐富，包括了酸味、甜味、苦味、鮮味等滋味特征，與總體滋味強度呈正相關；而傳統酸水乳餅總體滋味特征較弱，且伴有不愉悅的異味和淡淡的咸味。

圖2 乳餅樣品與感官屬性的PCAFig.2 PCA plot of sensory attributes of milk cake samples

表2 PC載荷矩陣Table 2 Principal component loading matrix

2.2 2 種酸化技術加工乳餅的呈味物質比較分析

2.2.1 游離氨基酸含量及TAV分析

乳餅中的游離氨基酸由加工和成熟期間蛋白質和多肽降解產生[24]，游離氨基酸種類和含量的增加有助于提高乳餅的營養價值，豐富乳餅的滋味[25]。由表3可知，發酵型乳餅的游離氨基酸總量（186.68～205.43 mg/kg）顯著高于傳統酸水乳餅（103.34～113.53 mg/kg），對增強乳餅的感官風味具有積極作用，田帥等[26]測定了酸水乳餅中的游離氨基酸含量，為85.93 mg/kg，與本研究略有差異，可能與乳源和加工用酸水有關。傳統酸水乳餅中谷氨酸、組氨酸、半胱氨酸含量較高；發酵型乳餅中谷氨酸含量最高，其次是組氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。在4 類呈味氨基酸中，鮮味氨基酸和甜味氨基酸是構成乳餅特殊滋味的最主要成分，雖苦味氨基酸含量較高，但呈苦味的氨基酸不具有味覺活性，被甜味和鮮味物質所掩蓋，最終使乳餅呈現獨特的鮮甜滋味[27]。TAV是滋味物質對于整體滋味的貢獻程度的表征指標，當TAV大于1時該物質被認為具有強烈的滋味活性，對整體滋味具有較大的貢獻[28]。在所有的游離氨基酸中，只有谷氨酸（SS：0.61～0.75；FJ：1.09～1.26）、纈氨酸（SS：0.15～0.18；FJ：0.27～0.30）、蛋氨酸（SS：0.22～0.27；FJ：0.32～0.34）、組氨酸（SS：0.92～1.04；FJ：1.35～1.51）和精氨酸（SS：0.13～0.19；FJ：0.11～0.14）5 種游離氨基酸的TAV大于0.1，但除組氨酸均小于1，表明以上5 種氨基酸對于乳餅滋味的貢獻最大，但仍未達到顯著影響的水平（除組氨酸外）。研究表明，谷氨酸可以提供強烈的鮮味，是重要的鮮味氨基酸[29-30]，此外，精氨酸可以與谷氨酸協同作用以提供令人愉快的整體味道。發酵型乳餅的鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量顯著高于傳統酸水乳餅（P＜0.05），賦予發酵型乳餅濃郁的滋味，與感官評價結果一致。

表3 乳餅中的游離氨基酸含量、閾值、呈味特性及TAVTable 3 Contents, thresholds in water, taste attributes and TVAs of free amino acids in milk cakes

2.2.2 游離脂肪酸含量及TAV分析

由表4可知，從傳統酸水乳餅和發酵型乳餅中共檢測到了10 種游離脂肪酸，其中油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量較高。發酵型乳餅中的游離脂肪酸總量在1 0343～1 0580 μg/g之間，顯著高于（P＜0.05）傳統酸水乳餅（9 335～10 000 μg/g），原因是乳酸菌發酵過程的脂肪分解，增加了乳餅中的游離脂肪酸含量，檢測到的游離脂肪酸以中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸為主，其中油酸（SS：3 564～3 651 μg/g；FJ：3 428～3 703 μg/g）和棕櫚酸（SS：2 382～2 803 μg/g；FJ：2 677～2 807 μg/g）是主要游離脂肪酸。癸酸（SS：0.73～1.36；FJ：0.8～1.13）、月桂酸（SS：206～362；FJ：332～406）、肉豆蔻酸（SS：1.49～1.95；FJ：1.84～2.05）、油酸（SS：1.78～1.85；FJ：1.71～1.79）和亞油酸（SS＜1；FJ：1.26～1.35）的TAV大于1，這5 種呈味脂肪酸對乳餅的滋味有著重要貢獻，其中月桂酸由于其閾值較低所以TAV最大。中長鏈游離脂肪酸中月桂酸、肉豆蔻酸、油酸和亞油酸與乳餅的酸味和苦味高度相關，它們主要賦予奶酪酸味和苦味[31]；癸酸具有不適的酸敗味[32]，可能與乳餅成熟過程的微生物作用有關。發酵型乳餅中肉豆蔻酸、亞油酸含量高于傳統酸水乳餅，所以酸味和苦味較強，和感官評分結果一致。綜上，不同中長鏈游離脂肪酸之間的協同作用共同構成發酵型乳餅和傳統酸水乳餅的特有酸香味和醇香味[33]。

表4 乳餅中的游離脂肪酸含量、閾值、呈味特性及TAVTable 4 Contents, taste thresholds, taste attributes and TAVs of free fatty acids in milk cakes

將游離氨基酸和脂肪酸含量進行歸一化處理后繪制聚類熱圖。從圖3A可直觀看出，谷氨酸、組氨酸，棕櫚酸和油酸在傳統酸水乳餅和發酵型乳餅的相對豐度較高，發酵型乳餅中大多數游離氨基酸豐度高于傳統酸水乳餅，而游離脂肪酸含量差異不明顯。Pearson相關分析用于確定關鍵滋味物質含量之間的相關性，如圖3B所示，月桂酸、癸酸、精氨酸、組氨酸、蛋氨酸之間呈正相關，油酸與月桂酸、癸酸以及纈氨酸、蛋氨酸、精氨酸、組氨酸呈正相關。

圖3 傳統酸水乳餅和發酵型乳餅的呈味物質熱圖（A）和關鍵呈味物質相關性熱圖（B）Fig.3 Heat map of flavor substances (A) and correlation heat map of key flavor substances (B) of traditional and fermented sour milk cakes

2.3 感官特性與風味物質的相關性分析

為了探究檢測得到的滋味物質對乳餅風味的貢獻程度，以檢測得到滋味物質作為X變量，感官屬性作為Y變量建立PLS感官評定與滋味物質的關系，從而推斷游離脂肪酸、游離氨基酸與感官屬性的相關性，2 個變量之間的距離說明兩者之間的相關性，位置越接近，正相關性越強，解釋性越強；兩者在距離圓心相反的位置，負相關性越強；兩者越垂直，越不相關。從圖4可知，咸味和異味與精氨酸、半胱氨酸、癸酸、油酸和棕櫚烯酸密切相關，酸味、甜味、鮮味和苦味與大多數氨基酸以及硬脂酸和亞油酸和十五烷酸密切相關。

圖4 感官屬性與游離脂肪酸（A）和感官屬性與游離氨基酸（B）PLS分析Fig.4 PLS analysis of correlation between sensory attributes and free fatty acids (A) and free amino acids (B)

為進一步研究感官屬性與特征呈味物質的相關性，Pearson相關系數關聯性分析用于確定每個感官屬性顯著相關的特征呈味物質。從圖5可以明顯看出，酸味、甜味、鮮味以及總體滋味強度和呈味物質基本呈正相關，特別和游離氨基酸相關性系數較高，而咸味、異味和呈味物質基本呈負相關。酸味與硬脂酸和亞油酸，甜味與天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸以及亞油酸，苦味與纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸等苦味氨基酸以及肉豆蔻酸均呈正相關；鮮味與天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸呈正相關，和甘氨酸和棕櫚烯酸呈負相關；總體滋味強度與大多數的呈味氨基酸呈正相關，與棕櫚烯酸呈負相關；咸味與精氨酸呈正相關；異味和甘氨酸、癸酸和棕櫚烯酸呈正相關，相關性均顯著（P＜0.05）。

圖5 感官屬性和呈味物質的相關性圖譜Fig.5 Correlation map between sensory attributes and taste compounds

3 結 論

研究測定了傳統酸水乳餅和發酵型乳餅的27 種呈味物質，采用TAV判定法確定7 種主要的特征呈味物質。在感官和呈味物質組成方面，2 種酸化技術加工的乳餅明顯區分開來，發酵型乳餅的呈味物質含量顯著高于傳統酸水乳餅（P＜0.05），感官屬性以酸味、甜味、苦味和鮮味為主，而傳統酸水乳餅伴有不愉悅的異味，說明乳酸菌發酵能提升乳餅的呈味物質含量，進而改善乳餅的風味。乳餅感官屬性與游離氨基酸相關性高，傳統酸水乳餅的咸味與精氨酸，異味與甘氨酸、癸酸與棕櫚烯酸呈顯著正相關（P＜0.05）；發酵型乳餅的酸味、甜味、鮮味和苦味與大多數特征呈味物質均有顯著相關性。綜上，發酵酸化技術能促進乳蛋白和脂肪的分解，改善乳餅的滋味，研究可為乳餅生產工藝的改善提供一定的科學依據。