富硒和非富硒雪櫻子中健康有益成分的對(duì)比分析

韓文娜，李喜貴，劉 煥，李 咪，靳登鵬，繆回春，李中意，朱思俞，柳春紅,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.廣東中普微量元素科技有限公司，廣東 廣州 510070；3.一輩子（廣東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510070；4.廣州市中科微量元素科學(xué)研究院，廣東 廣州 510070）

雪櫻子屬1 a生莧科植物，學(xué)名尾穗莧（Amaranthus caudatusL.），別名仙人谷、老槍谷，源于溫帶、亞熱帶及熱帶地區(qū)[1]。雪櫻子在我國(guó)各地均有分布。作為藥食兩用的雪櫻子具有極其重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]，其葉子中富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等基本營(yíng)養(yǎng)成分，可以作為蔬菜食用[3]，花籽粒中富含傳統(tǒng)谷物中缺乏的賴氨酸，可以當(dāng)作谷類食物食用[4]。除此之外，雪櫻子還含有多種生物活性化學(xué)成分，如多酚類、三萜皂苷類、生物活性肽、植物甾醇類[5-7]等。這些活性成分賦予雪櫻子特殊的功能特性，使其具有清除自由基、抵抗活性氧，發(fā)揮抗氧化的作用；也有刺激免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用；還有降低血糖血脂水平，改善高血壓、糖尿病等作用[8-10]。

硒作為生物體必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分，可以保護(hù)機(jī)體抵御疾病、延緩衰老，在人體抗氧化機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。硒缺乏會(huì)導(dǎo)致克山病、心臟病以及人體免疫機(jī)能的紊亂[12]，只靠天然食品補(bǔ)硒很難從根本上改善貧硒地區(qū)的硒缺乏狀況，而富硒產(chǎn)品的開發(fā)可作為補(bǔ)充硒元素的一個(gè)較好來源[13]，而且富含硒的食物也可以作為功能食品[14]。因此，在植物中補(bǔ)充硒元素不僅能夠?qū)崿F(xiàn)無機(jī)硒向有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化[15]，增加硒含量，而且有研究表明硒元素還可以促進(jìn)總多酚、總黃酮、礦物質(zhì)等含量的積累[16-19]，可以從根本上提高其健康有益成分[20]。近年來，富硒植物的開發(fā)研究已在世界各地范圍內(nèi)廣泛開展，鮮見文獻(xiàn)報(bào)道富硒雪櫻子體內(nèi)的生物活性成分及其功能作用。因此本研究通過對(duì)比富硒及非富硒雪櫻子的活性成分如多酚、黃酮、礦物質(zhì)的含量，以期為富硒雪櫻子及其制品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪櫻子種植于廣州江門地區(qū)，富硒雪櫻子通過噴施由一輩子（廣東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供的“微營(yíng)譜”牌植物硒營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行富硒處理，非富硒雪櫻子則不做任何處理。成熟后整株采摘，避光低溫保存。將雪櫻子的根、莖、葉、花4 個(gè)部位分別處理干凈后，置于真空冷凍機(jī)中凍干處理，使用粉碎機(jī)研磨至粉末狀，過60 目篩。粉末狀樣品裝入密封袋放入-20 ℃冰箱保存，備用。

沒食子酸（純度98%）、蘆丁（純度98%） 北京索萊寶科技有限公司；福林-酚試劑 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純） 天津科密歐試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-100F真空冷凍機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；300VDE超聲波清洗機(jī) 江蘇昆山超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Nexera X2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀 日本島津有限公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；1260/7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC-MS/MS定性定量分析

樣本預(yù)處理：稱取100 mg雪櫻子粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；將溶解后的樣品置于4 ℃冰箱過夜，期間渦旋6 次，提高提取率；12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

UPLC條件：色譜柱：SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%甲酸），B相為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.00 min，95% A，5% B；0.00～9.00 min，95%～5% A，5%～95% B；5% A，95% B，保持1 min；10.00～11.10 min，5%～95% A，95%～5% B；并以5% B平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V（正模式）/-4 500 V（負(fù)模式），氣簾氣壓力25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3.2 多酚含量測(cè)定

樣品提取：準(zhǔn)確稱取100 g雪櫻子粉末，用70%乙醇溶液以1∶25（g/mL）的物料比超聲浸提，浸提時(shí)間90 min，濾渣重復(fù)超聲提取2 次，合并提取液進(jìn)行真空抽濾，而后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，將獲得的濃縮液定容至100 mL，待測(cè)備用[21]。

采用福林-酚法測(cè)定雪櫻子粗提液中多酚含量[22]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%乙醇溶液定容10 mL，得到1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液。將母液依次稀釋成0、50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取125 μL的標(biāo)準(zhǔn)液加入125 μL的福林-酚試劑，混合后避光靜置6 min，加入7% Na2CO3溶液（1.25 mL），用水調(diào)至3 mL，避光放置90 min，于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：將雪櫻子粗提液樣品稀釋100 倍后，取125 μL樣品液按上述步驟測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算雪櫻子粗提液中多酚含量。

1.3.3 黃酮含量測(cè)定

樣品提取：同1.3.2節(jié)。

采用NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定雪櫻子粗提液中黃酮含量[23]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，用70%乙醇溶液定容至100 mL，得到0.12 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液。將母液依次稀釋成0、24、48、72、96、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液加入5% NaNO2溶液0.3 mL，混合后靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，混合后靜置6 min，在加入4% NaOH溶液4 mL，最后加70%乙醇溶液0.4 mL，搖勻后放置15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：將雪櫻子粗提液樣品稀釋100 倍后，取5 mL樣品液按上述步驟測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算雪櫻子粗提液中黃酮含量。

1.3.4 礦物質(zhì)含量的測(cè)定

鈣、鐵、鋅、硒、銅、鉬、鈷、鉻等微量元素參考GB 5009.268—2016《食品中多元素的測(cè)定》ICP-MS法測(cè)定。

樣本預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取300 mg樣品粉末于消解罐中，加入6 mL硝酸，2 mL過氧化氫搖勻，加蓋放置過夜，按照微波消解儀標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行消解，待消解完成，緩慢打開罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在控溫電熱板上加熱30 min，用水定容至25 mL，混勻備用，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

ICP-MS儀器工作條件：射頻功率1 548.6 W；等離子體氣流速13.9 L/min；載氣流速1.1 L/min；輔助氣流速0.8 L/min；霧化室溫度2 ℃；采樣深度5 mm；泵速40.0 r/min；掃描方式為跳峰；重復(fù)次數(shù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析，GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS/MS定性定量結(jié)果

色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了從利用色譜進(jìn)行物質(zhì)分離到利用質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)鑒定的整個(gè)流程，其中UPLC-MS/MS能夠準(zhǔn)確定性定量[24]。本研究選取富硒雪櫻子樣品，基于廣泛靶向代謝組技術(shù)的代謝分析，共檢測(cè)到725 個(gè)代謝物。圖1中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple response monitoring，MRM）模式代謝物檢測(cè)多峰圖展示了樣本中能夠檢測(cè)到的物質(zhì)，每個(gè)不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測(cè)到的一個(gè)代謝物。

圖1 MRM代謝物檢測(cè)多峰圖（A）和混合樣品質(zhì)譜分析總離子流圖（B）Fig.1 MRM chromatogram of metabolites in Se-enriched ACL (A) and total ion current chromatogram of mixed standards (B)

將檢測(cè)到的725 種代謝物歸類總結(jié)為12大類物質(zhì)（表1）。從雪櫻子中鑒定出酚酸類140 種、脂質(zhì)137 種、有機(jī)酸91 種、氨基酸及其衍生物85 種、黃酮類84 種、核苷酸及其衍生物50 種、生物堿35 種、木脂素及香豆素20 種、萜類14 種、糅質(zhì)4 種、醌類4 種、其他類61 種等生物活性成分，雪櫻子作為藥食兩用具有多種生理功能[25]。

表1 UPLC-MS/MS鑒定出的主要代謝物Table 1 Major metabolites identified by UPLC-MS/MS

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 活性成分含量對(duì)比分析

如表2所示，富硒后雪櫻子根、莖、葉、花部位的多酚含量顯著升高，其中根、葉、花部位多酚含量差異極顯著（P＜0.01），莖部差異顯著（P＜0.05），并且雪櫻子在富硒后葉片中的含量最高，達(dá)到了（13 272.1±106.6） mg/kg。表明富硒處理明顯提升了雪櫻子各部位中多酚的表達(dá)。同時(shí)經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，富硒雪櫻子根、莖部位的黃酮含量變化不顯著（P＞0.05），葉、花部位的黃酮含量變化極顯著（P＜0.01）。其中富硒后雪櫻子葉片中的黃酮含量最高，為（3 551.7±42.6）mg/kg，表明富硒處理明顯促進(jìn)了雪櫻子葉片中黃酮的表達(dá)。

表2 雪櫻子多酚、黃酮含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Contents of polyphenols and flavones in Se-enriched and non-Se-enriched ACL

2.3 礦物質(zhì)含量對(duì)比分析

通過ICP-MS測(cè)定鈣含量，從圖2A可以看出，雪櫻子富硒后可促進(jìn)鈣元素的吸收，其中葉片含量最高，達(dá)到34 481 mg/kg，鈣含量增長(zhǎng)39.5%；根部鈣含量次之，為10 125 mg/kg，相比于非富硒雪櫻子，差異變化較大。富硒后花中鈣含量為9 663 mg/kg，莖部含量最少為5 138 mg/kg，相比于非富硒雪櫻子，差異變化較小，表明富硒處理對(duì)雪櫻子的根、葉部位影響較大，對(duì)花和莖部位影響較小。

圖2 雪櫻子礦物含量檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Mineral contents in Se-enriched and non-Se-enriched ACL

由圖2B可知，雪櫻子根、莖、花部位的鐵元素在富硒后，含量表達(dá)均減少，而只有葉片中的鐵含量由非富硒的137 mg/kg上升到富硒的160 mg/kg，鐵含量增長(zhǎng)16.8%表明富硒促進(jìn)了雪櫻子鐵含量從其他部位向葉片的遷移。由圖2C、D可以看出，鋅元素在富硒雪櫻子的根、莖、葉、花四部位中的表達(dá)普遍下降，葉片中鋅含量降低76.4%，表明富硒降低了雪櫻子中的鋅含量。銅元素在富硒雪櫻子的根、莖、葉、花四部位中的表達(dá)普遍上升，并且葉片中的銅含量由非富硒的2.39 mg/kg上升到富硒的9.5 mg/kg，銅含量增長(zhǎng)297.5%，表明富硒促進(jìn)了雪櫻子葉片中銅元素的表達(dá)。

從圖2E、F發(fā)現(xiàn)，硒元素在富硒雪櫻子中的含量表達(dá)均提高，并且葉片中的硒含量由非富硒的0.34 mg/kg上升到富硒的3.91 mg/kg，硒含量增長(zhǎng)1 050.0%。鉬元素在富硒雪櫻子的葉、花部位中的表達(dá)上升，并且葉片中鉬含量由非富硒的0.28 mg/kg上升到富硒的0.59 mg/kg，鉬含量增長(zhǎng)110.7%，表明富硒促進(jìn)了雪櫻子葉片中鉬元素的表達(dá)。由圖2G、H可知，鈷元素在富硒雪櫻子根和葉中的含量表達(dá)上升，并且葉片中的鈷含量由非富硒的0.03 mg/kg上升到富硒的0.12 mg/kg，鈷含量增長(zhǎng)300.0%，表明富硒促進(jìn)了雪櫻子葉片中鈷元素的表達(dá)。雪櫻子根部鉻含量由非富硒的4.78 mg/kg下降為富硒的0.21 mg/kg，葉片中的鉻含量由非富硒的0.39 mg/kg上升到富硒的1.2 mg/kg，鉻含量增長(zhǎng)207.7%，含量差異變化較大。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)鉬、鈷、鉻等微量元素在富硒雪櫻子的其他部位中的含量變化較小，還有一些微量元素低于檢出限。但總體結(jié)果表明富硒雪櫻子的微量元素含量在根部表達(dá)減少，在葉片中表達(dá)升高。

2.4 富硒雪櫻子與有益成分含量的相關(guān)性分析

如表3所示，多酚與黃酮、礦物質(zhì)含量表現(xiàn)為正相關(guān)，且與黃酮、鉬顯著相關(guān)（P＜0.01）；黃酮與礦物質(zhì)含量正相關(guān)，且黃酮與鉬顯著相關(guān)（P＜0.05）；鈣與礦物質(zhì)正相關(guān)，且與銅顯著相關(guān)（P＜0.01），與硒、鉻顯著相關(guān)（P＜0.05）；鐵、鋅與礦物質(zhì)含量正相關(guān)，但鋅與鈷含量呈負(fù)相關(guān)；銅與硒顯著相關(guān)（P＜0.05）；硒與鉬顯著相關(guān)（P＜0.05）；鉬與鈷正相關(guān)。

表3 富硒雪櫻子與有益成分含量間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of health-benefiting components in Se-enriched ACL

3 討 論

通過UPLC-MS/MS驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，富硒雪櫻子中不僅富含多酚類、三萜皂苷類、植物甾醇類、生物活性肽等多種生物活性成分，還含有豐富的鈣元素及人體必需微量元素[26]。作為一種新型選擇的功能性食品蔬菜，富硒雪櫻子作用于人體的良好健康效果可能與其富含的植物化學(xué)物有關(guān)[27]，其中具有代表性的為多酚及黃酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，富硒后雪櫻子葉片中的多酚含量為（13 272.1±106.6） mg/kg，同時(shí)黃酮含量高達(dá)（3 551.7±42.6）mg/kg。Ademoyegun等[28]報(bào)道了雪櫻子的總多酚含量為10 670 mg/kg，與本結(jié)果較為一致。其間存在的差異可能與不同的測(cè)定方法、植物基因型、土壤類型、土壤礦物組成有關(guān)[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雪櫻子富硒后可實(shí)現(xiàn)無機(jī)硒向有機(jī)硒的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而提升活性成分的高效表達(dá)。其原因可能是由于富硒處理提高了有益微量元素硒含量，而硒元素主要以硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白質(zhì)內(nèi)，通過各種硒蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，以進(jìn)一步激活多酚、黃酮類化合物的代謝積累[30-32]。

研究發(fā)現(xiàn)雪櫻子成熟后可達(dá)1.5 m高左右，這種顯著區(qū)別于其他莧科植物的生長(zhǎng)特性，是進(jìn)一步挖掘雪櫻子礦物質(zhì)含量的必要條件。通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，雪櫻子花富硒后鈣含量為9 663 mg/kg，對(duì)比國(guó)外研究，Gamel等[33]發(fā)現(xiàn)雪櫻子花籽粒中的鈣含量為2 850 mg/kg。Amare等[34]通過分析植物中的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)雪櫻子的鈣含量高達(dá)7 768 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之類似。然而，植物富硒并不一定表明對(duì)其體內(nèi)的礦物質(zhì)含量都有促進(jìn)作用，相反，雪櫻子富硒后鐵（除葉片）、鋅元素含量呈下降趨勢(shì)。研究表明，高水平的鈣補(bǔ)充劑可能會(huì)導(dǎo)致或加重豆制品中鋅的利用不良，表明某個(gè)高水平的礦物質(zhì)攝入會(huì)對(duì)其他礦物質(zhì)產(chǎn)生相互作用[35]。其原因可能是植物中鈣含量較高時(shí)，易與植酸、草酸等結(jié)合，從而影響鐵、鋅的吸收，而且當(dāng)鈣鋅比例超過50∶1時(shí)，鈣會(huì)嚴(yán)重影響鋅的吸收[36]，表明硒元素與其他元素之間可能存在著復(fù)雜的相互作用，包括協(xié)同作用、拮抗作用和調(diào)節(jié)作用[37]。還有研究表明蛋黃中銅含量隨硒的添加而增加[38]，這與本研究的微量元素含量變化相類似，即雪櫻子在富硒后銅含量均得到提升，表明硒和銅元素具有協(xié)同作用，同時(shí)補(bǔ)充二者微量元素可以提高機(jī)體的抗氧化酶活性，以提高其抗氧化能力[39]。不僅如此，在富硒雪櫻子的葉片中也發(fā)現(xiàn)了鐵、硒、鉬、鈷、鉻等微量元素的上升趨勢(shì)，表明富硒處理可促進(jìn)某些微量元素從其他部位向葉片的遷移。即雪櫻子的葉片可能是微量元素的“聚集地”，并且這一作用通過富硒方式更加顯著。

富硒后，雪櫻子的根、莖、葉、花部位的多酚與黃酮、礦物質(zhì)含量正相關(guān)，黃酮與礦物質(zhì)含量正相關(guān)，除鋅與鈷呈負(fù)相關(guān)外，礦物質(zhì)含量間均呈正相關(guān)，這表明通過對(duì)具有相關(guān)性次生代謝物中一個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，可以初步評(píng)估另外一個(gè)指標(biāo)含量的高低[40]，即雪櫻子富硒與黃酮、多酚及礦物質(zhì)含量存在一定的量效關(guān)系。

4 結(jié) 論

富硒比非富硒雪櫻子含有更多的健康有益成分，尤其是富硒雪櫻子的葉片，不僅具有高水平的多酚及黃酮類化合物，還含有高豐度的鈣元素及微量元素。但基于國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，富硒雪櫻子作為一種藥食兩用的物質(zhì)一直未被開發(fā)利用，尤其是高鈣含量更是沒有被開發(fā)挖掘。因此，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)富硒雪櫻子的研究結(jié)果，在日常飲食中引入添加富硒雪櫻子的食品或藥材，對(duì)改善人體健康、預(yù)防和治療疾病可能會(huì)起到良好的促進(jìn)作用。