發酵劑對泡蘿卜品質的影響

經騏源，李 婷，曾凡坤，索化夷，王洪偉，宋佳佳，張 玉,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400715）

泡菜是中國傳統發酵食品，具有悠久的歷史文化，其中四川泡菜堪稱為中國“國粹”[1]。四川泡菜原料種類多樣，泡蘿卜是四川泡菜的典型代表[2]。新鮮蘿卜經密封發酵后，口感脆嫩，風味獨特，不僅可以作為佐餐食用，更是川菜制作過程中必備的調味菜[3]。除此之外，泡蘿卜富含乳酸菌，并具有抗癌、抗肥胖、抗氧化、抗衰老和抗糖尿病的特性[4]。從最初的家庭自制，到目前的工業化生產，泡蘿卜在中國乃至全世界都非常受歡迎[5]。

泡蘿卜在發酵過程中，微生物群落對其品質起至關重要的作用[6]。發酵過程中微生物利用原料組分作為底物代謝產生多種營養和風味物質，最終使產品具有獨特的營養價值和風味品質[7]。乳酸菌是發酵過程中起關鍵作用的微生物種群，其在發酵過程中產生的有機酸和二氧化碳能夠抑制腐敗菌的生長，從而提高產品的安全性[8]。但乳酸菌的生長代謝受多種因素的影響，如生長環境條件、發酵底物以及與其他微生物之間的相互作用等[9]。因此，工業化的泡蘿卜生產，除了控制發酵環境和發酵底物的穩定性之外，發酵劑的選擇顯得尤為重要。目前國內泡蘿卜的生產多采用自然發酵，得到的泡蘿卜品質參差不齊，因此，有針對性地開發泡蘿卜專用發酵劑對泡蘿卜工業化發展至關重要。

本研究選擇經過篩選能夠發酵得到較好品質的6 種泡蘿卜原液，經分析確定其微生物群落組成后，將其作為發酵劑接種發酵新的泡蘿卜，對比分析泡蘿卜發酵過程中的基本理化指標、質構特性，測定亞硝酸鹽、氨基酸、有機酸的含量，探索發酵過程中泡蘿卜品質的變化規律，以期獲得高品質泡蘿卜生產的專用發酵劑類型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的白蘿卜、食鹽購于重慶永輝超市；6 種不同微生物群落組成的泡菜原液來自重慶地區家庭制作（分別標記為發酵劑1、2、3、4、5和6）。

發酵劑1主要由布氏乳桿菌（66.26%（相對豐度，下同））、毛榛畢赤酵母（99.93%）和未分類的乳桿菌（12.58%）組成，菌落總數為1.04×106CFU/mL，pH 3.98，鹽度為5.5%。

發酵劑2主要由布氏乳桿菌（68.65%）、植物乳桿菌（28.64%）和毛榛畢赤酵母（99.99%）組成，菌落總數為7.35×106CFU/mL，pH 5.07，鹽度為3.0%。

發酵劑3主要由植物乳桿菌（30.79%）、布氏乳桿菌（14.81%）、未分類的乳桿菌（20.90%）和毛榛畢赤酵母（100.00%）組成，菌落總數為1.55×107CFU/mL，pH 3.99，鹽度為5.0%。

發酵劑4主要由植物乳桿菌（56.50%）、布氏乳桿菌（26.40%）、毛榛畢赤酵母（99.84%）和耐乙醇片球菌（15.65%）組成，菌落總數為5.45×106CFU/mL，pH 3.95，鹽度為3.0%。

發酵劑5主要由植物乳桿菌（43.63%）、布氏乳桿菌（39.87%）、耐酸乳桿菌（12.34%）和Issatchenkla orientalis（85.52%）組成，菌落總數為9.92×106CFU/mL，pH 2.54，鹽度為6.5%。

發酵劑6主要由植物乳桿菌（61.57%）、食竇魏斯氏菌（14.18%）、副銀念珠菌（10.14%）和其他（21.45%）組成，菌落總數為2.91×107CFU/mL，pH 2.55，鹽度為3.0%。

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、乙酸鈉、四硼酸鈉、對氨基苯磺酸、磷酸二氫鉀（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠；苯異硫氰酸酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、酚酞、三乙胺、正己烷、醋酸、磷酸（均為分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純） 重慶鈦新化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LC20A型高效液相色譜儀 日本島津公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CT3物性測定儀 美國Brookfield公司；5810臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；PB-10精密pH計德國Sartorius公司；HH-4恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；C21-SN216多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜的制備

將新鮮白蘿卜清洗瀝干后切成長寬25 mm、厚10 mm的塊狀，與等質量6%食鹽的涼開水溶液混合裝壇后，分別接種6 種泡菜原液（菌落數108CFU/mL，接種量見表1），在25 ℃恒溫條件下密封發酵，每天取樣測定各項指標，連續測定7 d。

表1 發酵劑接種量Table 1 Inoculum amounts of starters

1.3.2 pH值的測定

取25 g泡蘿卜與等量水混合勻漿，用pH計測定pH值[10]。

1.3.3 總酸的測定

取25 g泡蘿卜樣品，加入煮沸過的蒸餾水，搗碎后置于密閉玻璃容器中，轉移至250 mL容量瓶中，沸水水浴加熱30 min，中途搖動3 次，冷卻，定容后取25 mL濾液，用標準堿液進行滴定[11]。

1.3.4 質構特性測定

取長寬25 mm、厚10 mm泡蘿卜樣品置于質構儀下進行質構測定。質構測定參數：探頭AT44，測試速率1 mm/s，壓縮量50%，壓縮力7 g[12]。

1.3.5 亞硝酸鹽含量測定

參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定

參照文獻[13]方法。

氨基酸提取：取10 g泡蘿卜于80 ℃烘干后，置于研缽中研磨溶于25 mL去離子水，超聲處理30 min后離心取上清液待衍生化處理。

衍生：取上清液500 μL，分別加入衍生劑A（精密量取PITC 2 mL，用乙腈定容至10 mL）125 μL和衍生劑B（精密量取三乙胺2 mL，用乙腈定容至10 mL）500 μL，室溫暗處孵育1 h，加1 mL正己烷萃取2 次，每次10 min，吸取下層溶液與20 μL醋酸溶液混合，過0.22 μm濾膜。

色譜條件：C18氨基酸專用分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為乙腈-水（4∶1，V/V），流動相B為0.1 mol/L乙酸鈉溶液（乙酸調pH 6.5）-乙腈（97∶3，V/V），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫36 ℃，進樣量20 μL，梯度洗脫：0～11 min，0%～1.5% A，100%～98.5% B；11～21.7 min，1.5%～7.6% A，98.5%～92.4% B；21.7～23.9 min，7.6%～11% A，92.4%～89% B；23.9～39 min，11%～30% A，89%～70% B；39～42 min，30%～70% A，70%～30% B；42～45 min，70%～100% A，30%～0% B；45～52 min，100% A，0% B；52～55 min，100%～0% A，0%～100% B；55～70 min，0% A，100% B。

1.3.7 有機酸含量測定

參照文獻[14]方法。

有機酸提取：取一定質量泡蘿卜樣品，加等質量去離子水混合，制備成勻漿，稱取5 g勻漿于離心管中，4 000 r/min離心15 min，準確吸取上清液15 mL加入10 mL超純水，于75 ℃超聲處理20 min，再以12 000 r/min離心15 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾至2 mL進樣瓶中待色譜測定。

色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測器，流動相A為0.01 mol/L磷酸二氫鉀-水（3∶97，V/V）（pH 2.8），流動相B為甲醇，波長為210 nm。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用SPSS Statistics 25軟件進行統計分析，結果以±s表示；采用Origin 2018軟件進行作圖。質構測定重復6 次，其他指標分析均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 不同發酵劑對泡蘿卜pH值與總酸含量的影響

pH值和總酸含量是泡蘿卜發酵過程中重要的理化指標，與泡蘿卜品質和微生物生長情況密切相關[15]。由圖1可知，在發酵過程中，所有接種發酵劑蘿卜在發酵前期pH值顯著下降（P＜0.05），總酸含量顯著上升（P＜0.05），這與發酵劑中乳酸菌豐富、在發酵初期迅速成為優勢菌群而不受其他雜菌影響、產生大量酸有關[16]。所有泡蘿卜樣品在接種4～7 d pH值趨于穩定，這是由于產酸的增加，使乳酸菌的代謝活動受到一定的抑制作用[17]。接種發酵劑1、5、6泡蘿卜在接種6～7 d總酸含量下降，發酵劑1接種泡蘿卜總酸質量分數降低至（0.43±0.18）%，這是由于高鹽度的發酵劑的作用會使蘿卜組織細胞因滲透作用而脫水，蘿卜中所含有的一些可溶性酸就會隨著水分進入到泡蘿卜水中，導致泡蘿卜的總酸含量降低[18]。當泡蘿卜pH＜4、總酸質量分數＞0.3%時可認為發酵成熟[19]。由此可見，接種發酵劑1的泡蘿卜在接種3 d成熟，接種發酵劑2、4、5、6泡蘿卜在4 d成熟，接種發酵劑3泡蘿卜在5 d成熟。綜上，6 種發酵劑接種的泡蘿卜pH值和總酸含量的變化趨勢相同，且這6 種發酵劑在發酵7 d時對泡蘿卜的總酸含量的影響差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 發酵過程中pH值和總酸含量的變化Fig.1 Changes in pH and total acid content during fermentation

2.2 不同發酵劑對泡蘿卜質構的影響

質構是評價泡蘿卜品質的重要指標之一[20]。本研究從硬度和咀嚼性2 個指標反映泡蘿卜在不同發酵劑下發酵過程中質構的變化。泡蘿卜硬度主要與細胞壁原果膠成分有關，原果膠不溶于水且有黏著性，能黏連細胞并使蘿卜組織保持硬脆[21]。由圖2A可知，在發酵0 d，不同發酵劑接種泡蘿卜硬度差異不顯著（P＞0.05），發酵劑2接種泡蘿卜硬度（1 085.33±16）g略低于其他實驗組（P＞0.05）。發酵5 d，各實驗組蘿卜硬度下降，其中發酵劑5接種泡蘿卜硬度下降率為42.05%，其他組下降率在30%左右。發酵7 d，6 種發酵劑接種蘿卜硬度差異不顯著（P＞0.05），其中發酵劑3接種泡蘿卜硬度（1 022.67±226）g略高于其他組（P＞0.05）。

咀嚼性可以描述食品在口腔中被吞咽所需時間或咀嚼的次數，與硬度、彈性、凝聚性有關，反映了在咀嚼食物時牙齒對外力的抵抗作用[22]。由圖2B可知，發酵劑1、2、3、4、5接種泡蘿卜咀嚼性先增加后下降最后趨于穩定，發酵劑6接種泡蘿卜咀嚼性先迅速下降后趨于穩定。張慧敏等[23]將0.1%直投式發酵劑（主要菌種為植物乳桿菌550）與純乳酸混合發酵蘿卜，發現泡蘿卜咀嚼性有類似的變化趨勢。不同實驗組在發酵7 d后咀嚼性不顯著（P＞0.05），但發酵劑6對泡蘿卜咀嚼性影響最大。

圖2 發酵過程中硬度（A）和咀嚼性（B）變化Fig.2 Changes in hardness (A) and chewiness (B) during fermentation

2.3 不同發酵劑對泡蘿卜亞硝酸鹽含量的影響

飲食中約80%的硝酸鹽來自蔬菜消費[24]。由圖3可知，所有發酵劑接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量基本呈先上升后下降再上升的趨勢（0、4 d和5 d未檢測到）。在發酵7 d，發酵劑5和6接種泡蘿卜顯著低于其他實驗組亞硝酸含量（P＜0.05），其中發酵劑5接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量最低，為（1.28±0.2） mg/kg。Xiang Wenliang等[25]的研究表明食竇魏斯氏菌WC018和植物乳桿菌LP067共同接種發酵在抑制泡菜亞硝酸鹽的形成方面具有協同作用，這可能是發酵劑6接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量較其他組低的原因。所有實驗組泡蘿卜在發酵過程中的亞硝酸鹽含量都處于較低水平，其中最高的是發酵劑3接種的泡蘿卜，在發酵第6天時，亞硝酸鹽含量為（4.69±0.2）mg/kg。因此，所有實驗組所用發酵劑都能使泡蘿卜亞硝酸鹽含量在國標限量范圍內（20 mg/kg）。

圖3 發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in nitrite content during fermentation

2.4 不同發酵劑對泡蘿卜氨基酸含量的影響

共檢測了17 種氨基酸，其中包含5 種甜味氨基酸（蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸）、3 種鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸）、9 種苦味氨基酸（蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸和纈氨酸）的含量[26]。如表2所示，所有實驗組泡蘿卜甜味氨基酸的總含量在發酵前期波動較大，發酵后期穩定，其中丙氨酸占比最大。接種發酵劑2的泡蘿卜在發酵7 d總甜味氨基酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），其中蘇氨酸含量最高為（0.09±0.03）mg/g。發酵過程中，所有實驗組天冬氨酸在鮮味氨基酸中占比較低，微生物對天冬氨酸的利用率較高[27]。所有樣品泡蘿卜中苦味氨基酸總含量在發酵4 d達到峰值，在隨后的發酵過程中逐漸下降。其中苯丙氨酸和酪氨酸都含有苯環，在酶的催化下形成酚類化合物，是重要的風味前體物質[28-29]。在發酵第7天時，各實驗組氨基酸總含量差異顯著（P＜0.05），發酵劑6接種泡蘿卜甜味、鮮味、苦味氨基酸含量均偏低，發酵劑2接種泡蘿卜甜味和鮮味氨基酸顯著高于其他組（P＜0.05），其中谷氨酸含量最高，為（0.18±0.01）mg/g。

表2 發酵過程泡蘿卜中游離氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids in pickled radish during fermentation

2.5 不同發酵劑對有機酸含量的影響

有機酸是泡蘿卜風味和滋味的重要因素[30]。在泡蘿卜發酵過程中，有機酸的產生和消耗以及種類由微生物群落的組成和生長環境所決定[31]。本研究主要分析了8 種有機酸，包括草酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸（表3）。

表3 發酵過程泡蘿卜有機酸含量Table 3 Contents of organic acids in pickled radish during fermentation

新鮮蘿卜中草酸含量較高，發酵劑4接種泡蘿卜在0 d草酸含量高達（11.74±3.62）mg/g。隨著發酵時間的延長，所有泡蘿卜的草酸含量均有下降。發酵7 d，各實驗組草酸含量差異不顯著（P＞0.05），含量最高是發酵劑3接種泡蘿卜，為（3.64±0.39）mg/g。在發酵過程中，泡蘿卜酒石酸含量均呈先下降后穩定的趨勢，發酵劑3接種泡蘿卜發酵7 d后，酒石酸含量最高為（0.10±0.07）mg/g。泡蘿卜抗壞血酸變化趨勢與酒石酸類似，終含量最高的是接種發酵劑1的泡蘿卜，達（0.24±0.02）mg/g。琥珀酸在所有發酵劑發酵過程中的含量始終處于低水平，呈下降趨勢。琥珀酸作為三羧酸循環的中間產物，參與微生物的代謝過程，除此之外，還會與亞硝酸鹽進行反應，生成微溶性鹽等，都會導致其含量的降低[32]。

蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸是泡蘿卜發酵過程含量上升的有機酸，也是發酵過程中主要生產有機酸。乳酸是泡蘿卜中的主要有機酸，它的產生和積累主要取決于糖的代謝和接種物的底物供應[33]，在本研究中，乳酸主要是由植物乳桿菌產生。所有實驗組中乳酸含量呈先增加后穩定趨勢。發酵7 d時，各實驗組之間差異不顯著（P＞0.05），其中接種發酵劑2泡蘿卜所含有的乳酸含量較其他組略高，為（0.19±0.13）mg/g。在發酵過程中，各實驗組之間乙酸含量差異顯著（P＜0.05），尤其是在發酵后期。發酵7 d時，發酵劑1、2、3接種泡蘿卜乙酸含量分別為（2.39±1.25）、（2.1±0.59）、（2.27±0.33）mg/g，而發酵劑4、5、6接種泡蘿卜乙酸含量在1.4 mg/g左右。根據Ozcelik等[34]的報道，在泡菜發酵過程中，乙酸只由腸系膜乳酸菌產生，植物乳桿菌不產生，而在本研究中，植物乳桿菌和布氏乳桿菌或食竇魏斯氏菌組成的體系均可以產生乙酸，且乙酸濃度顯著高于乳酸（P＜0.05）。

發酵過程中檸檬酸變化趨勢均為先增加后降低，發酵劑2接種7 d后檸檬酸含量最高達（1.11±0.03）mg/g。檸檬酸鹽和葡萄糖果糖、乳糖或木糖在多種乳酸菌的作用下通過醋酸鹽激酶途徑代謝，導致檸檬酸含量逐漸降低[35]。所有實驗泡蘿卜中蘋果酸含量在后期較高，其中發酵劑1接種泡蘿卜在第5天蘋果酸含量達到（3.93±0.11）mg/g。發酵7 d，發酵劑2接種泡蘿卜蘋果酸含量最高，為（1.31±0.31）mg/g。總之，發酵7 d，發酵劑2接種泡蘿卜有機酸含量顯著高于其他實驗組（P＜0.05），且乳酸、乙酸等關鍵風味物質廣泛存在，能給予泡蘿卜良好的風味品質[12]。

3 結論與討論

在泡蘿卜發酵過程中，通過接種發酵劑，可以使乳酸菌迅速成為優勢菌種，加速泡蘿卜成熟。6 種發酵劑對泡蘿卜的基本理化指標、質構特性影響差異不顯著（P＞0.05），均能使泡蘿卜亞硝酸鹽含量在國家限量標準內，但由布氏乳桿菌（68.65%）、植物乳桿菌（28.64%）和毛榛畢赤酵母（99.99%）組成發酵劑2能使泡蘿卜氨基酸和有機酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），賦予泡蘿卜良好的風味和營養價值。在本研究中接種的發酵劑被稱為“老鹵水”，是在泡菜壇內長期厭氧發酵形成的乳酸菌為主體的復合菌群[36]。發酵劑2中所含的植物乳桿菌、布氏乳桿菌是泡蘿卜發酵過程中的優勢菌群，對各種風味和營養物質的產生具有重要的作用。毛榛畢赤酵母是發酵劑2中的主要真菌，常存在自然發酵食品中（例如葡萄酒、黃瓜、食用橄欖等）[37]。因此，通過對發酵劑2的進一步研究有望得到發高品質泡蘿卜專用發酵劑的發酵機制。