赤紅球菌組氨酸激酶的融合表達和功能分析

吳鐘昊，彭 仁

（江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

組氨酸激酶是一種膜蛋白，它的功能主要發生在雙組分系統途徑中。在原核生物中，雙組分系統通常僅限于兩個功能模塊之間的通信——組氨酸激酶和反應調控蛋白之間的磷酸化轉移。在經典的原核系統中，信號感知可調節組氨酸激酶在保守組氨酸殘基上的自磷酸化，然后轉移至組氨酸激酶的C端結構域中的保守天冬氨酸殘基，最后傳遞至反應調控蛋白的保守天冬氨酸殘基，從而磷酸化反應調控蛋白影響下游基因的轉錄[1]。組氨酸激酶是細菌信號轉導的中心，它的多樣性、多功能性、廣泛的分布以及與下游相關組件配合的特殊性，使其成為生物治療[2]和生物技術操作[3]的重要目標，并成為生物傳感器系統工程的基礎[4-5]。

紅球菌作為一類重要的模式微生物，在自然環境中分布廣泛且菌株種類多樣。它具有降解有機污染物[6-8]、生物轉化[9-10]、產色素[11]和胡蘿卜素[12]、產表面活性劑[13]、降解毒素[14]等作用，在環境治理、生物合成與轉化以及醫藥領域都具有潛在的應用價值。目前尚鮮有紅球菌組氨酸激酶的研究報道。

赤紅球菌（Rhodococcus ruber）SD3是1 株耐受多種有機溶劑耐受菌，在前期工作中發現在苯酚和甲苯的脅迫下，組氨酸激酶基因的表達均發生下調。為研究組氨酸激酶在R.ruberSD3獨特生理特性中的作用，本研究通過異源表達得到有活性的組氨酸激酶融合蛋白，并確定組氨酸激酶與R.ruber有機溶劑耐受性之間的關系，旨在為進一步揭示R.ruberSD3中組氨酸激酶涉及的信號轉導途徑與R.ruber有機溶劑耐受性的關聯機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

R.ruberSD3保存于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO：M2012035。pGEX-4T-2質粒、大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10和BL21（DE3）感受態保存于本實驗室。

胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基二乙胺、還原型谷胱甘肽、核酸染料、ATP、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；蛋白質濃度測定試劑盒 上海Beyotime公司；質粒小量提取試劑盒 美國Axygen公司；GoTaq?GreenMaster Mix、Kinase-GloTMLuminescent Kinase Kit 美國Promega公司；BamH I、Hind III等限制性內切酶、T4 DNA連接酶 美國New England Biolabs公司。

1.2 儀器與設備

721紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；TC-XP-G XP基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司；JY96-IIN細胞破碎儀 上海凈信實業發展有限公司；2524DN-384-04 24DN型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；MBE-150水平凝膠電泳儀 美國Major Science公司；E5331 GloMax熒光測量儀 美國Promega公司；Nano-200超微量核酸分析儀 杭州奧盛儀器有限公司；D3024R高速冷凍離心機 美國SCILOGEX公司；MicroPulserTM電轉儀 美國Bio-Rad公司；ekspertTMnano液相色譜系統、Triple TOF 5600-plus高分辨串聯質譜美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1R.ruberSD3組氨酸激酶基因（rhk）密碼子優化和基因合成

對rhk基因（GenBank的序列登錄號為MN688330）進行序列分析，發現其稀有密碼子較多，GC含量較高，存在一些重復序列，并且存在一段跨膜區。為了能在E.coli中進行有效表達，采用通用生物公司開發的密碼子優化軟件對R.ruberSD3的rhk基因進行序列優化，將序列優化后的基因命名為rhks。該基因已將原基因中終止密碼子去掉，其5’端和3’端分別加上限制性酶切位點分別為BamHI（G/GATCC）和EcoRI（G/AATTC），然后由通用生物公司合成帶有限制性酶切位點的rhks基因。

1.3.2 構建含重組質粒pGM-T-rhks的E.coliTOP 10菌株

將rhks基因與pGM-T載體按pGM-T克隆試劑盒的操作步驟進行16 ℃過夜酶連，酶連產物轉化至E.coliTOP 10感受態細胞：然后在LB固體平板篩選陽性克隆，并進行菌落聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和DNA序列鑒定。

1.3.3 構建含重組質粒pGEX-4T-2-rhks的E.coli重組菌

將pGM-T-rhks重組質粒和pGEX-4T-2質粒進行雙酶切，之后進行瓊脂糖凝膠電泳，并按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟回收酶切產物，在16 ℃條件下進行過夜酶連，將酶連產物轉化到E.coliBL21（DE3）感受態細胞中，篩選陽性克隆并進行菌落PCR和DNA序列鑒定。

1.3.4 組氨酸激酶基因的表達及其表達條件優化

將含重組質粒pGEX-4T-2-rhks（重組質粒圖譜見圖1）的陽性克隆轉接到含氨芐青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培養基，培養到菌液OD600nm為0.6～0.8，取1 mL菌液作為未誘導的對照樣品，剩余菌液加1 mmol/L IPTG溶液誘導，在37 ℃、180 r/min條件下再誘導培養8 h，分別將1 mL IPTG誘導的菌液和1 mL未誘導菌液在12 000×g離心2 min，去掉上清液，加150 μL 1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）充分重懸，分別取10 μL未誘導與誘導的重懸液，各加入10 μL的1×蛋白質上樣緩沖液，短暫離心后沸水浴10 min，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

圖1 重組質粒pGEX-4T-2-rhksFig.1 Map of recombinant plasmid pGEX-4T-2-rhks

為了達到最大的可溶性表達，對含有pGEX-4T-rhks重組質粒的E.coliBL21（DE3）重組菌株進行表達條件優化，分別設置不同的誘導溫度（16、20、25 ℃）、誘導時間（4、6、8 h）和IPTG濃度（0.1、0.5、1 mmol/L）。

1.3.5 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的純化

根據上述最優培養條件培養重組菌，將菌液在5 000 r/min離心10 min，然后將菌體放入-40 ℃冰箱冰凍1 h以上，再加入PBS（pH 7.4）破碎緩沖液（含5 mmol/L二硫蘇糖醇、0.1% TritonX-100和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）。將菌懸液進行超聲破碎，其中功率為60 W，破碎時間為3 s，間隙5 s，破碎總時間為15 min。破碎液4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液。將破碎裂解液上清液經0.45 μm的濾膜過濾后上柱，加入預冷的1×PBS清洗層析柱，每次加入2 mL，共10 mL，然后加入預冷的Tris-HCl溶液（pH 8.0）洗滌層析柱，每次加入2 mL，共10 mL。加入15 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫液（pH 8.0）洗脫融合蛋白。每次1 mL，共10 mL，收集洗脫液，測定蛋白質濃度，將含有蛋白質的洗脫液合并，得到純化的組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK。在提純過程中，分別取15 μL破碎裂解液、破碎裂解液上清液、破碎裂解液沉淀、最后收集的洗滌液和含有蛋白質的洗脫液進行SDS-PAGE分析。

1.3.6 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

將純化的重組蛋白GST-RHK進行SDS-PAGE，切下目的膠條。加入終濃度10 mmol/L二硫蘇糖醇還原蛋白質，接著加入終濃度55 mmol/L碘乙酰胺，最后加入1 μg的Trypsin酶，過夜酶解8～16 h。酶解產生的多肽用C18柱除鹽，已經除鹽的多肽抽干后用15 μL Loading Buffer（含0.1%甲酸和3%乙腈）溶解多肽。多肽上LC-MS/MS儀器進行分析，然后對結果進行評估。

1.3.7 酶活性的測定

采用Kinase-GloTMLuminescent Kinase Kit檢測樣品的激酶活性。取10 μL樣品與5 μL ATP溶液混合，使反應體系中ATP終濃度為5 μmol/L，25 ℃反應10 min，在避光條件下各加入50 μL發光試劑，25 ℃反應10 min，在GloMax熒光測量儀上測定熒光值。本研究規定在25 ℃和pH 7.5條件下1 min內酶催化消耗1 nmol ATP為1 U。

1.3.8 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK的酶促反應動力學

取10 μL融合蛋白GST-RHK分別與40 μL濃度為2、4、6、8、10 μmol/L和12.5 μmol/L的ATP溶液混合，使ATP終濃度分別為 1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 μmol/L和10 μmol/L，25 ℃反應10 min，然后在避光條件下加入50 μL熒光試劑，25 ℃反應10 min，在GloMax熒光測量儀上測量熒光值。

1.3.9 pNV18-rhkE強化質粒的構建

使用細菌基因組提取試劑盒提取R.ruberSD3基因組，以此為模板進行PCR擴增，使用TOLOBIO生物公司的2×P6 High-Fidelity Premix，rhkE的正向引物為5’-ATGGATCCGTGAGCCGCGTACGGCC-3’（BamHI），反向引物為5’-CGAAAGCTTTCACTCCA CCGGCATCCGC-3’（Hind III）。PCR條件：94 ℃預變性2 min；隨后94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，此3 步驟循環30 次，72 ℃再延伸5 min，于4 ℃低溫保存。采用天根DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟進行切膠回收純化PCR產物，于-40 ℃保存。

將上述PCR產物與pNV18質粒用BamHI和HindIII進行雙酶切，用DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟回收酶切產物，然后過夜酶連，之后轉化到E.coliTOP10感受態，挑取轉化后的單菌落進行搖菌培養，隨后進行菌落PCR和測序鑒定，陽性克隆中含有pNV18-rhkE強化質粒。

1.3.10 pNV18-rhkD敲減質粒的構建

使用細菌基因組提取試劑盒提取R.ruberSD3基因組，以此為模板進行PCR擴增，使用TOLOBIO生物公司的2×P6 High-Fidelity Premix，rhkD的正向引物為5’-CGAAAGCTTGTGAGCCGCGTACGGCC-3’（Hind III），反向引物為5’-ATGGATCCTCACTCCACCGGCATCCGC-3’（BamHI）[15]。PCR條件：94 ℃預變性2 min；隨后94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，此3 步驟循環30 次，72 ℃再延伸5 min，于4 ℃低溫保存。采用天根的DNA瓊脂糖膠回收試劑盒步驟進行切膠回收純化PCR產物，并-40 ℃保存。

同樣按1.3.9節方法構建pNV18-rhkD敲減質粒。

1.3.11 基因增強株sdrhkE和基因敲減株sdrhkD的制備

培養含有pNV18-rhkE、pNV18-rhkD重組質粒的E.coliTOP10菌株，提取兩種質粒。按照所示方法制備R.ruberSD3感受態細胞[16]，將pNV18-rhkE、pNV18-rhkD重組質粒分別電轉到R.ruberSD3感受態細胞，其中電壓為1.5 kV，電擊時間為5.6 ms，挑取轉化后的單菌落進行搖菌培養，隨后進行菌落PCR和測序鑒定，于是分別獲得sdrhkE基因增強株和sdrhkE基因敲減株。

1.3.12 sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株中組氨酸激酶基因表達的實時PCR（real-time PCR）分析

sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株中總RNA的提取按照Kuang Sufang等[17]的方法。

real-time PCR分析組氨酸激酶基因表達情況的正向引物序列為CAACCTCGTCACCAACGC，反向引物序列為GATAGAAACGCTCGAAGACCC。16S rRNA基因作為內參基因，其正向引物序列為ACTGGGCGTAAAGAGYTCGT，反向引物序列為CGCATTTCACCGCTACAC。反應體系含有2×SYBR Green Mix（5 μL），上游引物和下游引物均為0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL，然后用雙蒸水補至10 μL。其程序設定：95 ℃預變性5 min；隨后95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸25 s，此3 步驟共40 個循環[17]。real-time PCR結果采用2-ΔΔCt相對定量法進行分析[18]。

1.3.13 sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株在有機溶劑脅迫下的生長情況

分別制備野生型R.ruberSD3、sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株的種子液，將種子液1 mL分別轉移至100 mL LB液體培養基，再分別加入終質量濃度為0.1 g/100 mL的苯酚、0.1%（V/V）甲苯、0.1%（V/V）氯苯、0.1%（V/V）異辛烷，于35 ℃、200 r/min的恒溫搖床內培養，分別在12、24、36、48、60 h和72 h測量培養菌株的OD600nm值。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 重組質粒pGEX-4T-2-rhks的構建

按1.3.4節步驟進行雙酶切，回收酶切產物，然后將回收產物進行酶連，轉化到BL21（DE3）感受態細胞，篩選得到陽性克隆后進行菌落PCR，電泳結果見圖2，條帶大小符合預期。送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果與預期基因序列相符，說明表達質粒pGEX-4T-2-rhks構建成功。

圖2 含有重組質粒pGEX-4T-2-rhks的E.coliBL21（DE3）菌落PCR鑒定Fig.2 PCR identification of E.coli BL21(DE3) colonies containing recombinant plasmid pGEX-4T-2-rhks

2.2 組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK表達條件的優化

膜蛋白與營養物質和代謝產物跨膜運輸、信號轉導、細胞間通訊和細胞形態的維持等多種細胞功能有關。盡管它們在細胞中發揮起重要作用，但是膜蛋白表達仍然是蛋白質表達中的難點。為使膜蛋白組氨酸激酶能夠有效表達，本研究嘗試了不同的質粒，最后確定pGEX-4T-2作為重組表達質粒。pGEX-4T-2表達載體含有GST標簽，通常此標簽能夠增強蛋白可溶性和提高蛋白表達量，可在不同的宿主中表達，純化條件溫和，并且能保留了蛋白的生物活性[19]。如圖3所示，組氨酸激酶融合蛋白GST-RHK獲得成功表達。同時本實驗為了獲得更大的表達量，還進行了誘導條件的優化。SDS-PAGE結果表明在OD600nm達到0.6～0.8時加入1 mmol/L IPTG，25 ℃誘導8 h表達量最大（圖3）。錢英子等[20]用pET-28a作為載體表達了變形鏈球菌組氨酸蛋白激酶VicK，其中在最優的表達條件為IPTG終濃度0.3 mmol/L，18 ℃誘導15 h。這說明低溫可能更適合組氨酸激酶的表達。

圖3 pGEX-4T-2-rhks表達條件優化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for optimization of expression conditions of pGEX-4T-2-rhks

2.3 GST-RHK蛋白的純化

分別取全蛋白、菌株裂解液上清液、菌株裂解液沉淀、最后收集的洗滌液、洗脫液與1×蛋白質上樣緩沖液按1∶1的比例混勻，沸水浴10 min，然后取10 μL進行SDS-PAGE鑒定，如圖4所示，在上清液中表達較多，沉淀中表達較少，說明大多數融合蛋白以可溶性的形式表達，因此將細胞裂解液的上清液用于親和層析純化。圖4泳道4表明在純化過程中已將雜蛋白洗滌干凈。泳道5～8洗脫液中，第7和第8泳道中對應的洗脫液中有更多的目的蛋白。經谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化，獲得電泳純的GST-RHK融合蛋白，其中純化倍數為3.1，得率為19.5%（表1）。

圖4 GST-RHK蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis for purification of GST-RHK protein

表1 GST-RHK蛋白質的純化結果Table 1 Summary of the purification process of GST-RHK protein

2.4 GST-RHK融合蛋白的LC-MS/MS分析

當設置可信度conf≥95%、Unique peptides≥1時，GST-RHK融合蛋白LC-MS/MS產生的二級譜圖數為1 326，解析的二級譜圖數為9，蛋白質覆蓋率為25.81%。序列顯示為綠色其可信度在95%以上（圖5）。結果表明純化得到的蛋白為目的蛋白。

圖5 經質譜分析獲得的肽段與GST-RHK蛋白的覆蓋度Fig.5 Coverage of peptide fragments obtained by LC-MS/MS in the sequence of GST-RHK

2.5 GST-RHK融合蛋白的分子質量和酶促反應動力學分析

根據GST-RHK融合蛋白的SDS-PAGE圖譜，計算得到GST-RHK融合蛋白的分子質量為72.75 kDa，與理論值72.17 kDa基本一致。采用雙倒數作圖法，計算得到GST-RHK融合蛋白的Km和Vmax分別為20.92 μmol/L和0.17 μmol/（L·min）（圖6），進一步計算得到Kcat值為1.4 min-1。Tawa等[21]測得E.coli中組氨酸激酶CheA的Kcat值約為0.028 s-1，說明這兩種激酶的催化能力相當。

圖6 GST-RHK融合蛋白的Km和Vmax值測定Fig.6 Determination of Km and Vmax of GST-RHK fusion protein

2.6 sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株中組氨酸激酶基因的表達情況

pNV18質粒是E.coli和紅球菌之間的穿梭質粒，能用于紅球菌中表達蛋白質[22-23]。將組氨酸激酶基因正向連接到pNV18質粒上建構組氨酸激酶基因強化質粒，然后將組氨酸激酶基因部分反向連接到pNV18質粒上建構組氨酸激酶基因敲減質粒，然后采用real-time PCR進一步鑒定是否成功構建sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株，并分析組氨酸激酶基因的表達變化情況。如圖7所示，與野生型R.ruber相比，sdrhkE基因增強株中組氨酸激酶基因的表達擴大到原來的46.57 倍。sdrhkD基因敲減株組氨酸激酶基因的表達減少到原來的5%。說明增強質粒中的組氨酸激酶基因表達后有效提高了R.ruber中總的組氨酸激酶mRNA含量，然而敲減質粒產生的反義RNA能夠和R.ruber基因組產生的組氨酸激酶mRNA結合，從而能夠降低組氨酸激酶基因的表達。

圖7 R.ruber SD3野生株、增強株和敲減株中組氨酸激酶基因轉錄變化情況Fig.7 Transcriptional change of histidine kinase gene in wild-type,sdrhkE enhancement, and sdrhkD knockdown strains

2.7 有機溶劑脅迫下sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株的生長情況

為研究組氨酸激酶基因對R.ruberSD3有機溶劑耐受性的影響，實驗測定野生型R.ruber、sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株在不同有機溶劑存在情況下的生長曲線。如圖8所示，在苯酚、甲苯、氯苯、異辛烷4 種有機溶劑脅迫下，在前24 h內，野生型R.ruber、sdrhkE基因增強株、sdrhkD基因敲減株生長情況區別較小，在24～72 h，上述3 種菌株生長情況呈現差異。其中sdrhkD基因敲減株的生長情況都優于野生型R.ruberSD3，sdrhkE基因增強株的生長情況都低于野生型R.ruberSD3。這些結果表明組氨酸基因表達下調使菌株有機溶劑耐受性增加，然而組氨酸基因表達上調使菌株有機溶劑耐受性下降。在前期研究中發現R.ruberSD3在甲苯和苯酚處理下，組氨酸激酶基因均下調，這說明R.ruberSD3的有機溶劑耐受性和組氨酸激酶基因負相關，和R.ruberSD3、sdrhkE基因增強株和sdrhkD基因敲減株的生長情況一致。

圖8 不同有機溶劑處理下野生株、敲減株和增強株的生長曲線Fig.8 Growth curves of wild-type, sdrhkD knockdown and sdrhkE enhancement strains cultured in the presence of different organic solvents

3 討 論

紅球菌屬于專性好氧的革蘭氏陽性菌，由于其具有代謝多樣性和功能的多樣性，能夠廣泛用于環境修復、生物轉化、生物合成等方面。目前對紅球菌屬在分類[24]、組學[17,25]、遺傳改造[26]及其應用等方面開展了許多研究，然而對于紅球菌的信號轉導途徑有待于進一步深入研究。對于生物制備和生物修復過程，紅球菌屬微生物都會接觸化學物質，其中一些化學物質對微生物具有一定毒性，影響微生物的生長和代謝，因此紅球菌如何感知這些化學物質信號并作出響應是紅球菌研究中一個重要的科學問題。

組氨酸激酶介導的信號轉導途徑廣泛存在各種細菌中，它作為雙組分信號轉導系統的一部分，參與調控細菌的各種生命活動，包括營養物質的獲取、代謝作用、適應環境的變化、孢子和生物膜形成、毒性等[27]。在適應環境的變化中往往涉及滲透壓、光、趨藥性、溫度、氧等因素。例如E.coli的EnvZ-OmpR雙組分系統中EnvZ是一種組氨酸激酶，它感受到外界滲透壓的變化進而調節細胞的滲透壓[28]。Deng Chaoying等[29]發現在野油菜黃單胞菌組氨酸激酶VgrS與該菌的滲透壓抗性相關。另外一種與細菌趨化系統密切相關是一種組氨酸激酶CheA，其中趨化受體MCP感受外界刺激，并通過組氨酸激酶CheA和反應調節器CheY將信號傳遞給鞭毛馬達，從而使得細菌趨向或遠離化學物質[30]。迄今為止鮮見有R.ruber中有關組氨酸激酶的研究報道。本研究從R.ruberSD3中克隆了組氨酸激酶基因，并成功地進行了融合表達。融合蛋白與E.coli中組氨酸激酶CheA的激酶活性相當。此外，本研究通過pNV18質粒增強或降低了組氨酸激酶的表達，并且發現組氨酸基因的表達變化與R.ruber的有機溶劑耐受性相關，然而尚未發現其他菌株存在該現象。目前還未找到組氨酸激酶的底物，因此組氨酸激酶如何對R.ruber有機溶劑耐受性產生影響的分子機制還有待于進一步研究。

4 結 論

本研究從R.ruberSD3發現了一種新的組氨酸激酶，證實了其激酶活性，并且它與R.ruberSD3的有機溶劑耐受性存在關聯，通過強化或敲減該組氨酸激酶可以改變R.ruberSD3的有機溶劑耐受性，這些研究結果為進一步揭示組氨酸激酶介導的信號轉導途徑與R.ruberSD3有機溶劑耐受性提供研究依據，也為R.ruberSD3的遺傳改造提供了新的靶標。