羧甲基魔芋葡甘露聚糖對豌豆蛋白水分散液的穩(wěn)定性作用

陶 冉，李瑞琪，郭亞龍，韋 越，張洪斌

（上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240）

除傳統(tǒng)意義上的中性蛋白飲料（如牛奶）外，酸性蛋白飲料由于營養(yǎng)豐富、口感獨特，逐漸在蛋白飲料消費市場占據(jù)重要地位。相比于市場上長期大量存在的動物蛋白（主要為酪蛋白）飲料，近年來，消費者對中性與酸性植物蛋白飲料的需求不斷增加[1-2]。豌豆蛋白作為一種植物來源的天然可持續(xù)性蛋白質(zhì)，不僅價格低、營養(yǎng)價值高、致敏性低，還具有降低膽固醇、血壓等獨特生理活性[3-4]，是代替動物蛋白用于食品配方的可靠原料之一，無疑在蛋白飲料行業(yè)具有更強的應(yīng)用前景[5-7]。然而，豌豆蛋白因表面疏水性強且電荷量低，導(dǎo)致其在水中的溶解度低、物理穩(wěn)定性差[8-9]。尤其在酸性條件下，當(dāng)體系pH值接近蛋白質(zhì)等電點時，豌豆蛋白易發(fā)生聚集，使體系穩(wěn)定性進一步大幅降低[9]，因此豌豆蛋白在酸性蛋白飲料中的應(yīng)用受到很大限制。如何控制豌豆蛋白在中性特別是酸性條件下的穩(wěn)定分散，是豌豆蛋白飲料發(fā)展的主要瓶頸問題。

一些天然生物大分子多糖作為增稠劑、乳化劑、膠凝劑和穩(wěn)定劑等，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[10-12]。通過多糖與蛋白質(zhì)相互作用，可以阻止或減緩蛋白質(zhì)的聚集和沉降，提高蛋白分散液的物理穩(wěn)定性[11,13-14]。多糖對蛋白分散液體系的穩(wěn)定主要有2 種作用機制：一是在酸性條件下，聚陰離子多糖，如果膠[10,15-16]、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）[17-19]或大豆可溶性多糖[20]，可與帶正電荷的蛋白顆粒形成靜電復(fù)合物，通過靜電排斥和空間位阻保持蛋白質(zhì)分散液的穩(wěn)定性[9]。這些多糖與酪蛋白膠束發(fā)生靜電吸附，在蛋白膠束表面形成了刷狀或環(huán)狀吸附結(jié)構(gòu)，從而阻止了蛋白膠束的酸誘導(dǎo)聚集使體系穩(wěn)定。二是，添加的多糖在體系中形成高分子物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)，增加了連續(xù)相的黏度，從而阻礙和遲滯了蛋白顆粒的聚集和沉降[21]。而對于添加了聚陰離子多糖的酸性乳體系，上述2 種穩(wěn)定作用均會存在。作為多相多組分復(fù)雜體系的多糖-蛋白分散液，其穩(wěn)定性與諸多因素有關(guān)，除加工工藝的影響外[19]，多糖穩(wěn)定劑本身的結(jié)構(gòu)和性能是穩(wěn)定體系的主導(dǎo)因素，特別是多糖分子參數(shù)（如分子質(zhì)量及取代度和取代分布）對體系物理穩(wěn)定性起著決定性作用[17-18,22]。

在乳液制品研究領(lǐng)域，對高性能穩(wěn)定劑的需求和對穩(wěn)定劑不同穩(wěn)定機理的闡明一直處于不斷發(fā)展中。近期對魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）、CMC和玉米纖維膠以及羧甲基改性的玉米纖維膠（carboxymethylated corn fiber gum，CMCFG）提高豌豆蛋白分散液（pea protein dispersion，PPD）穩(wěn)定性的能力進行比較研究發(fā)現(xiàn)，KGM的添加可通過增黏作用實現(xiàn)PPD在中性和酸性（pH 3.5）條件下的物理穩(wěn)定，羧甲基化的CMC和CMCFG則通過與豌豆蛋白的靜電吸附促成了體系的穩(wěn)定[21]。目前，對高濃度、高分子質(zhì)量和高取代度的多糖有利于乳狀液穩(wěn)定逐漸形成了共識，但穩(wěn)定劑分子的分子質(zhì)量和取代度同時變化時如何影響乳狀液的行為尚不清晰。

KGM具有天然的生物相容性、生物可降解性、增稠性、膠凝性和成膜性等，同時作為優(yōu)良的膳食纖維和食品原料，還具有降低血液膽固醇和血糖含量以及促進腸道消化和特異免疫功能的特性，已被廣泛用于食品、化工和生物醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[12,23-25]。盡管KGM具有諸多功能特性和健康益處，但水溶性低以及低濃度下的高黏性也造成制得的乳飲料口感不佳。羧甲基化是一種常用的多糖安全改性方法，改性不僅能改善多糖水溶性而且還能在很大程度上保留其生物活性[26]。研究表明，羧甲基魔芋葡甘露聚糖（carboxymethylated konjac glucomannan，CMKGM）可在保持KGM原有生物相容性和增稠性的基礎(chǔ)上，大大提高其水溶性和水溶液穩(wěn)定性[27-29]。本研究基于合成的一系列具有不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM，通過對體系粒徑、Zeta電位、表觀黏度和不穩(wěn)定性指數(shù)的測定，著重研究CMKGM在分子質(zhì)量和取代度同時變化的情況下對PPD穩(wěn)定行為的影響，評估其在中性和酸性條件下對PPD的穩(wěn)定效果，并分析其不同穩(wěn)定機理，以期發(fā)展新型乳飲料穩(wěn)定劑，為植物蛋白基飲料配方的開發(fā)提供有價值的技術(shù)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KGM 湖北一致魔芋生物科技股份有限公司；NUTRALYS?S85F豌豆分離蛋白（純度85%） 法國羅蓋特公司；鹽酸和檸檬酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水為實驗室自制；CMKGM為基于文獻[27]方法，制備7 種不同分子質(zhì)量和不同取代度的樣品，見表1。

表1 不同取代度的CMKGM樣品信息Table 1 Information about CMKGM with different degrees of substitution

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MZ3004磁力攪拌器 上海志威電器有限公司；Milli-Q Plus超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；HAAKE MARSIII旋轉(zhuǎn)流變儀 美國Thermo Fisher公司；高壓均質(zhì)機 美國NanoDeBEE公司；LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀 德國LUM GmbH公司；Zetasizer Nano-ZS90粒徑分析儀 英國馬爾文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 PPD的制備

稱取一定量的豌豆分離蛋白分散于超純水中，在室溫下攪拌1 h，并用高壓均質(zhì)機在50 MPa下循環(huán)均質(zhì)7 次，獲得質(zhì)量分數(shù)1%的PPD。將CMKGM樣品溶于超純水中，配制不同質(zhì)量分數(shù)的多糖溶液，然后將1% PPD與多糖溶液以1∶1的質(zhì)量比混合后攪拌1 h，采用500 g/kg的檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，繼續(xù)攪拌1 h，獲得多糖穩(wěn)定的蛋白分散液。

1.3.2 不穩(wěn)定指數(shù)測試

采用穩(wěn)定性分析儀對新鮮制備的PPD-多糖復(fù)合物（中性和pH 3.5）進行穩(wěn)定性測試。測試條件：轉(zhuǎn)速3 000 r/min，光源865 nm，測試時長1.0 h，溫度25 ℃。

1.3.3 Zeta電位和粒徑測試

將PPD-多糖復(fù)合物分別用相應(yīng)pH值的去離子水稀釋100 倍，采用粒徑分析儀分別測定體系在中性和pH 3.5條件下的Zeta電位和平均粒徑，測試溫度25 ℃，每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.4 表觀黏度測試

在控制應(yīng)力流變儀上進行PPD體系的穩(wěn)態(tài)剪切流動行為測試。測試條件：采用60 mm平行板，平行板之間的間隙為0.5 mm，溫度25 ℃，剪切速率范圍0.01～1 000 s-1。實驗時在夾具邊緣滴加輕質(zhì)硅油（10 mPa·s）進行密封，以減少實驗過程中的水揮發(fā)，樣品在測試溫度下靜置平衡5 min后開始測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量分數(shù)一定條件下不同CMKGM對PPD體系的穩(wěn)定效果比較

如圖1所示，在透射曲線上，紅線表示樣品初始狀態(tài)的透過率，綠線代表測試進行過程中樣品的透過率。在離心過程中，密度大的分散相逐漸遷移到樣品管底部，從而使上清液部分的透過率增加。通過透射曲線的變化可以反映出分散液的穩(wěn)定性。一般而言，在離心過程中，透過率變化越大，樣品越不穩(wěn)定。基于透射曲線還能獲得樣品的不穩(wěn)定指數(shù)，可定量表征不同樣品穩(wěn)定性的大小（圖2）。不穩(wěn)定指數(shù)的數(shù)值介于0～1之間，其中0表示體系非常穩(wěn)定，而1代表體系非常不穩(wěn)定。在穩(wěn)定性評估中，以不穩(wěn)定指數(shù)達到0.2或以下為穩(wěn)定標準。

圖1 中性和pH 3.5條件下質(zhì)量分數(shù)1%的KGM和CMKGM的1% PPD的透過率變化Fig.1 Transmittance evolution of 1% PPD stabilized by 1% KGM or different CMKGM samples at neutral and acidic (pH 3.5) conditions

圖2 中性和pH 3.5條件下質(zhì)量分數(shù)1%的KGM和CMKGM的1% PPD的不穩(wěn)定指數(shù)Fig.2 Instability index of 1% PPD stabilized by 1% KGM or different CMKGM samples at neutral and acidic conditions

由圖1、2可知，在不添加穩(wěn)定劑的情況下，PPD在中性和pH 3.5下均不穩(wěn)定，且酸性條件下的不穩(wěn)定程度遠大于中性條件。這是由于豌豆蛋白在水中的溶解度低，在離心過程中容易發(fā)生聚集[9]，特別是當(dāng)pH值降低，接近豌豆蛋白等電點（～pH 4.5）時，蛋白顆粒之間的靜電斥力減弱，更加劇了蛋白膠束的聚集和沉降。多糖的添加在很大程度上改善了體系的穩(wěn)定性。僅質(zhì)量分數(shù)1%的中性KGM，PPD在中性和酸性條件下都能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。由于不產(chǎn)生有效吸附，這主要是由于KGM的增黏作用[21]。在中性條件下，當(dāng)添加1%的具有不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM樣品時，僅有CMKGM-1能夠有效穩(wěn)定PPD，其他樣品（CMKGM-2～CMKGM-7）均不能起到穩(wěn)定作用。由于在中性條件下，豌豆蛋白顆粒和多糖分子均帶負電荷，多糖的穩(wěn)定作用主要來源于其增黏作用，然而對于CMKGM-2～CMKGM-7樣品，由于分子質(zhì)量逐漸降低，在相同質(zhì)量分數(shù)下（1%）不能起到有效的增黏作用，故不能穩(wěn)定PPD。在pH 3.5條件下，CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3均能在一定程度上保持PPD的穩(wěn)定，這是因為在酸性條件下豌豆蛋白帶正電，帶負電的CMKGM能夠與豌豆蛋白發(fā)生靜電吸附使PPD-多糖復(fù)合物帶負電，從而通過靜電排斥作用和空間位阻作用阻礙蛋白顆粒的聚集。再加上未吸附多余多糖分子的增黏作用，兩者共同維持了PPD體系的穩(wěn)定。然而，盡管CMKGM-4～CMKGM-7這4 個樣品的羧甲基的取代度增加有利于發(fā)揮其在酸性條件下穩(wěn)定PPD體系中的靜電排斥作用，但是由于分子質(zhì)量過低導(dǎo)致增黏作用大幅減弱，使這些樣品在質(zhì)量分數(shù)1%的條件下不能穩(wěn)定酸性PPD體系。

2.2 不同分子參數(shù)CMKGM對穩(wěn)定PPD體系的臨界添加量

如前所述，雖然添加質(zhì)量分數(shù)1%的KGM能夠有效穩(wěn)定中性和酸性PPD體系，但對于不同的CMKGM樣品，由于分子質(zhì)量降低，在相同的添加量下（1%），大多數(shù)CMKGM不能有效穩(wěn)定PPD體系。因此，確定不同取代度和不同分子質(zhì)量CMKGM的臨界穩(wěn)定添加量，對于CMKGM在PPD體系穩(wěn)定中的開發(fā)和利用具有重要指導(dǎo)意義。如圖3A所示，CMKGM的分子質(zhì)量越低，達到穩(wěn)定所需的臨界多糖添加量也越高。從CMKGM-1的1%，增大到CMKGM-7的20%才能穩(wěn)定PPD。由此可見，盡管取代度高，但分子質(zhì)量的高低是CMKGM穩(wěn)定PPD的主導(dǎo)因素。過低的分子質(zhì)量，不僅對PPD體系連續(xù)相的增黏效果減弱，而且吸附后不能在蛋白顆粒表面形成有效的空間位阻作用。需要指出，對于CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3這3 個樣品，達到體系物理穩(wěn)定（不穩(wěn)定指數(shù)小于0.2）所需的多糖質(zhì)量分數(shù)均在2%以下，從實際應(yīng)用的角度更具有經(jīng)濟性。而且相比于未改性的KGM，改性后CMKGM的水溶性增加、分子質(zhì)量有所降低，有望改善KGM黏度高帶來的不良口感。

圖3 中性和pH 3.5條件下不同CMKGM的臨界穩(wěn)定添加量（A）和相應(yīng)PPD-多糖體系的不穩(wěn)定指數(shù)（B）Fig.3 Critical stabilization concentrations (A) of KGM and different CMKGM samples for 1% PPDs and instability index (B) of systems at neutral and acidic conditions

2.3 PPD-CMKGM靜電復(fù)合物的Zeta電位分析

PPD-多糖靜電復(fù)合物的穩(wěn)定性在很大程度上取決于分子之間的引力和斥力。Zeta電位可以反映顆粒之間靜電相互作用的強弱。如圖4所示，在中性條件下復(fù)合物的Zeta電位為負值，在酸性條件下為正值，且絕對值較小。加入KGM后，由于KGM為中性多糖，對Zeta電位影響較小。在中性條件下，加入相同質(zhì)量分數(shù)的CMKGM后，復(fù)合物Zeta電位絕對值隨取代度增加而增加。這是因為取代度越高，CMKGM所帶負電荷量越高。在酸性條件下，加入相同質(zhì)量分數(shù)的CMKGM后，Zeta電位由正變負，且絕對值隨取代度的增加而增加。這是因為CMKGM吸附到豌豆蛋白表面形成靜電復(fù)合物。此外，從圖4A和圖4B對比分析可以看到，無論在中性還是酸性條件下，對于同一種CMKGM，復(fù)合物Zeta電位的絕對值隨CMKGM質(zhì)量分數(shù)的增加而增大。總之，CMKGM的取代度越高，質(zhì)量分數(shù)越大，復(fù)合物的Zeta電位絕對值越大。在中性條件下，豌豆蛋白和CMKGM都帶負電，2 種生物高分子會發(fā)生熱力學(xué)不相容，不利于體系穩(wěn)定；同時豌豆蛋白上的局部正電荷可能與CMKGM發(fā)生靜電吸附形成少量靜電復(fù)合物，促進體系穩(wěn)定。在酸性條件下，帶正電的豌豆蛋白與帶負電的CMKGM發(fā)生靜電吸附形成大量靜電復(fù)合物，復(fù)合物顆粒之間的靜電斥力和空間位阻有利于體系穩(wěn)定。

圖4 中性和pH 3.5條件下當(dāng)多糖質(zhì)量分數(shù)為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1% PPD的Zeta電位Fig.4 Zeta potential of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and at crititical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

2.4 PPD-CMKGM靜電復(fù)合物的粒徑分析

根據(jù)斯托克斯定律，較小的粒徑和較高的連續(xù)相黏度有利于減緩顆粒的沉降速度，從而有助于提高分散液的物理穩(wěn)定性[30]。在中性條件下，在PPD中加入質(zhì)量分數(shù)1%的CMKGM后，粒徑表現(xiàn)出不同程度的增加（圖5A）。其原因主要從以下兩方面考慮：第一，豌豆蛋白和CMKGM的熱力學(xué)不相容促使蛋白發(fā)生聚集；第二，CMKGM通過與豌豆蛋白上的局部正電荷發(fā)生靜電吸附包覆于表面。在酸性條件下，在PPD中加入質(zhì)量分數(shù)1%的CMKGM后，粒徑也有不同程度的增加，而且相比于取代度較低的樣品，取代度較高的樣品導(dǎo)致粒徑增加較少。一方面，這是因為取代度越高的樣品帶電量大，與蛋白之間的吸附更為緊密；另一方面，高取代度樣品的分子質(zhì)量本身也小于低取代度樣品（表1）。此外，在中性和酸性條件下，對于同種CMKGM，加入的多糖質(zhì)量分數(shù)越大，復(fù)合物的粒徑越大（圖5B），這是因為CMKGM質(zhì)量分數(shù)的增加使蛋白表面吸附的多糖數(shù)量增多，甚至可能發(fā)生多層吸附。

圖5 中性和pH 3.5條件下當(dāng)多糖質(zhì)量分數(shù)為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1% PPD的粒徑Fig.5 Particle size of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and at crititical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

2.5 PPD-CMKGM體系的表觀黏度分析

當(dāng)多糖添加量為1%和臨界穩(wěn)定添加量時，PPD-多糖體系的表觀黏度如圖6所示。對比分析圖6A1和A2可以看出，無論是中性還是酸性條件下，由于CMKGM分子質(zhì)量隨取代度升高而降低，加入相同質(zhì)量分數(shù)1%的CMKGM，PPD體系的黏度隨CMKGM取代度的增大而減小，其中CMKGM-2和CMKGM-3在50 s-1的剪切速率下的黏度處在0.1～2 Pa·s之間，這對于飲料來說黏稠性較為合適。對于同種多糖樣品，在相同條件下，體系在酸性條件下（pH 3.5）的黏度均低于中性條件。這是因為CMKGM作為聚陰離子多糖，分子鏈上的部分—COO-基團在酸性條件下被質(zhì)子化，使分子鏈內(nèi)的靜電斥力減小，分子構(gòu)象更為緊湊，使體系的黏度降低；同時，由于帶負電的多糖分子可與帶正電的豌豆蛋白發(fā)生靜電吸附，故相比于中性條件，在酸性條件下起增黏效果的CMKGM分子數(shù)量減少，也導(dǎo)致體系黏度的降低。

當(dāng)增大CMKGM的質(zhì)量分數(shù)使體系在中性（圖6B1）和酸性（圖6B2）條件下達到物理穩(wěn)定時，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，即添加相同質(zhì)量分數(shù)的同種多糖時，在酸性條件下體系的黏度仍小于相應(yīng)的中性條件。這進一步表明，在酸性條件下使體系達到物理穩(wěn)定所需的增黏作用小于中性條件。CMKGM在酸性體系中的穩(wěn)定作用在于吸附的CMKGM與蛋白質(zhì)形成靜電復(fù)合物增加了顆粒之間的靜電斥力和空間位阻，同時未吸附的CMKGM可增加連續(xù)相的黏度，這與CMC在蛋白分散液酸性體系中的穩(wěn)定作用相類似[17-18]。在不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM樣品中，CMKGM-2和CMKGM-3在較小的添加量下即可使PPD體系在酸性和中性條件下都能達到較好的穩(wěn)定效果，而且黏度較KGM有所下降，可以改善KGM作為穩(wěn)定劑的濃稠口感，對于飲料生產(chǎn)具有更好的適用性。

圖6 當(dāng)多糖質(zhì)量分數(shù)分別為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1%PPD在中性和pH 3.5的表觀黏度Fig.6 Apparent viscosity of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and critical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

3 結(jié) 論

比較具有不同取代度和分子質(zhì)量的CMKGM對中性和酸性PPD體系物理穩(wěn)定性的影響。盡管高分子質(zhì)量和高取代度穩(wěn)定劑通常均有利于PPD體系穩(wěn)定而低分子質(zhì)量和低取代度均不利于體系穩(wěn)定，但在CMKGM的分子質(zhì)量和取代度同時變化的情況下，CMKGM分子質(zhì)量的降低和取代度的增加對PPD的穩(wěn)定有復(fù)雜的影響。隨著取代度的增加，在分子質(zhì)量逐漸降低的情況下，達到PPD體系穩(wěn)定所需的CMKGM的質(zhì)量分數(shù)逐漸增大，CMKGM分子質(zhì)量對體系穩(wěn)定性的影響大于取代度。在所制備的7 個改性樣品中（CMKGM-1～CMKGM-7，分子質(zhì)量依次降低而取代度依次升高），高分子質(zhì)量低取代度的CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3在小于質(zhì)量分數(shù)2%條件下即可使中性和酸性PPD體系均能達到良好的物理穩(wěn)定性，而低分子質(zhì)量高取代度的CMKGM需在較高的質(zhì)量分數(shù)條件下才能穩(wěn)定PPD體系。靜電排斥、空間位阻效應(yīng)和連續(xù)相高黏度為CMKGM提高PPD穩(wěn)定性的主要因素。中性條件下，由于CMKGM不發(fā)生吸附，其對連續(xù)相的增黏作用是體系穩(wěn)定的主導(dǎo)因素，而在酸性條件下，CMKGM對連續(xù)相的增黏作用和CMKGM與豌豆蛋白形成靜電復(fù)合物后產(chǎn)生的靜電斥力和空間位阻作用共同促使了體系的穩(wěn)定。