液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定多種獸藥殘留方法中標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性的挑戰(zhàn)

Lidija Kenjeric, Michael Sulyok, Alexandra Malachova, David Steiner,Rudolf Krska,?, Brian Quinn, Brett Greer, Christopher T.Elliott

（1. 奧地利飼料和食品質(zhì)量、安全和創(chuàng)新能力中心，奧地利 圖爾恩 3430；2. 奧利地維也納自然資源與生命科學(xué)大學(xué)，生物分析與農(nóng)業(yè)代謝組學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)系，奧地利 圖爾恩 3430；3. 英國(guó)貝爾法斯特女王大學(xué)，生物科學(xué)學(xué)院，全球食品安全研究所，英國(guó) 北愛爾蘭 貝爾法斯特 BT9 5DL；4. 奧地利Romer實(shí)驗(yàn)室診斷有限公司，分析服務(wù)部，科技園5，奧地利 圖爾恩 3430）

不同類型獸藥的極性、溶解性和穩(wěn)定性方面差別極大，在多種獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)方法開發(fā)時(shí)應(yīng)特別關(guān)注[1]。大多數(shù)獸藥標(biāo)準(zhǔn)品是固體形式，需準(zhǔn)確稱重和溶解。對(duì)于溶解而言，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須確保所使用的溶劑能夠溶解標(biāo)準(zhǔn)品并不會(huì)使標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生降解。因此，SANTE指南[2]和歐盟委員會(huì)決議 2002/657/EC 文件[3]均指出標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性是方法驗(yàn)證的先決條件之一。當(dāng)開發(fā)溶解在不同溶劑中的不同亞類的獸殘同時(shí)分析方法時(shí)，需尋找一種簡(jiǎn)便的標(biāo)液配制操作方法。目前解決方案為將溶解在同一溶劑中的所有化合物分成一組配制成中間混合液[4-5]，然后將這些不同中間混合液配制成最終的混合儲(chǔ)備液，并通過逐級(jí)稀釋獲得外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。因此需要確定中間混合液和最終的混合儲(chǔ)備液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性以及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的短期穩(wěn)定性。然而目前只有Desmarchelier等報(bào)道了大量獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性[6]。本文考察了150種以上不同類別的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，超過120種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品在混合儲(chǔ)備液中的穩(wěn)定性為一周，在中間混合液的穩(wěn)定性為12周。這些穩(wěn)定性結(jié)果有望為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）多獸藥殘留分析方法中標(biāo)準(zhǔn)品的正確管理和使用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HPLC級(jí)乙腈和甲醇以及MS級(jí)冰醋酸（p.a.）、乙酸銨：Sigma-Aldrich（奧地利，維也納）；獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich（奧地利，維也納）、Dr. Ehrenstorfer（德國(guó)，奧格斯堡）、歐盟標(biāo)物研制實(shí)驗(yàn)室（德國(guó)，柏林）或不同研究團(tuán)隊(duì)贈(zèng)送。本研究所檢測(cè)的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（>CL）根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)分為18類，具體如下：

（1）驅(qū)蟲劑：芬苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑砜、三苯達(dá)唑砜、三氯苯達(dá)唑亞砜、三苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、亞苯砜、阿苯達(dá)唑、氯苯達(dá)唑、羥氯唑唑、氯苯達(dá)唑、奧昔苯達(dá)唑、左苯咪唑、氟苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑胺、莫蘭特、硝基硝酸吡蘭替唑、噻苯達(dá)唑

（2）抗原蟲類：羅硝唑、雙甲硝唑、奧硝唑、卡硝唑、異丙唑

（3）大環(huán)內(nèi)酯類：多粘菌素、異粘菌素、莫粘菌素

（4）磺胺類藥物：磺胺吡啶、磺胺乙氧嘧啶、氨砜、磺胺乙酰胺、磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺惡唑、磺胺米特、磺胺甲嗪、磺胺甲唑、磺胺甲惡唑、磺胺洛嗪、磺胺苯唑、酞基磺胺噻唑、甲氧芐氨嘧啶（抗葉酸抗菌劑-與磺胺類協(xié)同作用）、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶

（5）氨基糖苷類藥物：鏈霉素、阿帕霉素、二汗鏈霉素、卡那霉素、新霉素B、紫蘇霉素

（6）大環(huán)內(nèi)酯類：螺旋霉素、油甘霉素、交沙霉素、林可霉素、克林霉素、紅霉素 A、羅紅霉素、替米可霉素、泰樂菌素

（7）四環(huán)素：脫環(huán)素、甲環(huán)素、甲環(huán)素、二諾環(huán)素、氯四環(huán)素、氧四環(huán)素、強(qiáng)力環(huán)素

（8）喹諾酮類藥物：馬博沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、雙氟沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、全氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、沙氟沙星、哌啶酸、西諾沙星

（9）硝基咪唑類：甲硝唑

（10）側(cè)耳菌素：粘菌素

（11）截短側(cè)耳素：沃尼秒林、泰妙菌素

（12）β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林、氨芐西林、雙氯西林、苯唑西林、他唑巴坦、哌拉西林、替卡西林、舒巴坦、克拉維酸

（13）青霉素：青霉素G、青霉素V、鄰氯青霉素、阿斯泊西林（aspoxicilin）不確定沒查到

（14）頭孢菌素類：頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、地氟頭孢噻呋、頭孢匹林、頭孢氯銨、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢曲利、頭孢喹諾、頭孢氨芐

（15）球菌類：克拉珠利、地克珠利、尼卡巴星、氯吡氯吡醇、氟富甲酮、乙氧巴坦、羅本尼丁、德奎寧、莫能菌素、沙林霉素、拉沙洛啶、馬杜拉明、奈奎寧、氨丙利銨、二硝基哌利特

（16）抗生素類：甲砜霉素、氟芬尼考、氯霉素

（17）非甾體抗炎藥：酮洛芬、萘普生、美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬、雙氯芬酸、布洛芬、甲芬氨酸、托芬氨酸、非羅昔布、塞來昔布

（18）糖皮質(zhì)類固醇：地塞米松、氟沙松、甲基搶的松龍、倍他米松、潑尼松龍、曲安奈德。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫 1290 超高效液相：Agilent Technologies，沃爾德布朗，德國(guó)；配有TurboV電噴霧電離（ESI）源的 Q Trap 5500 MS/MS：Sciex，福斯特市，加州，美國(guó)；C18保護(hù)柱：Phenomenex，托倫斯，加州，美國(guó)；超純水系統(tǒng)制備：ELGA Lab Water，塞勒，德國(guó)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

參考Desmarchelier等論文，根據(jù)分析物在特定溶劑中的溶解性制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液[6]。固體標(biāo)準(zhǔn)品稱量（最小稱量量為 1 mg），選擇合適的溶劑定容，配制成目標(biāo)濃度為1 000 μg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液超聲直到固體完全溶解。由于化合物的溶解性不同，最終使用了六種不同的溶劑：水、甲醇、甲醇+水（1∶1）、甲醇+二甲亞砜（DMSO）（1∶1）、水+乙腈（1∶1）、含1 mM氫氧化鈉的甲醇。最終，除用水配制的中間混合液存于15 mL falcon離心管中外，其余5種中間混合液配制于10 mL容量瓶，濃度為10 μg/mL。將相同溶劑的單標(biāo)儲(chǔ)備液混合并用對(duì)應(yīng)的溶劑定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品中間混合液。所有標(biāo)準(zhǔn)品溶液全部保存于-20 ℃。附件列明了174個(gè)單標(biāo)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液的詳細(xì)信息。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

使用乙腈：水（體積比為1∶1）作為溶劑1∶1、1∶3、1∶10、1∶30、1∶100 逐級(jí)稀釋配制凈溶液外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。使用 MultiQuant2.0.2軟件（Sciex，F(xiàn)oster City，CA，USA）采用 1/x權(quán)重對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察凈溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性。

1.5 檢測(cè)方法

本實(shí)驗(yàn)在Malachová等[7]的分析方法基礎(chǔ)上，通過質(zhì)譜條件優(yōu)化增加新化合物的 MRM 離子對(duì)。檢測(cè)儀器：安捷倫1290超高效液相串接配備TurboV 電噴霧電離（ESI）源的 Q Trap 5500 MS/MS。色譜柱：Gemini C18，（150×4.6 mm，5 μm），C18 保護(hù)柱（4×3 mm），柱溫 25 ℃。流動(dòng)相：5 mM乙酸銨，甲醇∶水∶乙酸=10∶89∶1（v/v/v；洗脫液 A）和 97∶2∶1（v/v/v；洗脫液 B），超純水由實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制備，流速1 mL/min。梯度洗脫程序：初始流動(dòng)相100A%并保持2 min，在3分鐘內(nèi)B相線性增加到50%，在9分鐘內(nèi)繼續(xù)線性增加到100% B，保持4 min，然后在2.5分鐘內(nèi)回到流動(dòng)相初始比例。進(jìn)樣量5 μL，ESI-MS/MS是在兩個(gè)單獨(dú)色譜條件下，分正負(fù)極，分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（sMRM）模式下進(jìn)行采集。ESI源參數(shù)：源溫度為550 ℃，氣簾氣為30 psi（最大壓力為99.5%氮?dú)?206.8 kPa）、離子源氣體 1（鞘氣）80 psi（氮?dú)?551.6 kPa）、離子源氣 2（干燥氣體）80 psi（氮?dú)?551.6 kPa）、離子噴霧電壓分別為?4 500 V和+5 500 V、碰撞氣體（氮?dú)猓橹卸取Ｔ谡x子和負(fù)離子ESI模式下，目標(biāo)化合物循環(huán)周期為1 000 ms，MS 暫停時(shí)間為 3 ms，檢測(cè)窗口寬度分別為 40 s（ESI+）和 52 s（ESI-）。根據(jù) SANTE指南[2]，每個(gè)分析物選擇兩個(gè) MRM 離子對(duì)來進(jìn)行定性確證。

1.6 穩(wěn)定性研究

獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性研究采取等時(shí)測(cè)量法，即在不同的溫度下儲(chǔ)存不同時(shí)長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)品，必須同時(shí)進(jìn)行測(cè)量以考察獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性[8]。等時(shí)測(cè)量法首先將所有獸藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存在-80 ℃和-20 ℃條件下，以防止發(fā)生降解，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案將獸藥標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到不同的溫度下進(jìn)行不同時(shí)間段的穩(wěn)定性測(cè)試。

1.6.1 短期穩(wěn)定性研究

將不同種類的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液分別取30 μL（總體積 180 μL）混合，用等體積的提取溶劑（乙腈∶水∶乙酸，79∶20∶1，v/v/v）和稀釋溶劑（乙腈∶水∶乙酸，20∶79∶1，v/v/v）混合溶劑定容至1 mL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別移取 50 μL于 13個(gè)進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，用450 μL的溶劑稀釋配制成濃度為30 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別使用溶劑乙腈∶水（1∶1，v/v）、乙腈∶水∶乙酸（79∶20∶1，v/v/v），用同樣的方法配制含酸和不含酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。短期穩(wěn)定性考察以-20 ℃為參照條件、+4 ℃（冰箱）和室溫（避光或不避光）為不同溫度儲(chǔ)存條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液存儲(chǔ)1、2、4和7 d，在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)后的第二天，將所有不同儲(chǔ)存條件下及參照條件（-20 ℃）下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液取出并恢復(fù)至室溫后進(jìn)行隨機(jī)序列檢測(cè)，以避免因檢測(cè)引起的任何趨勢(shì)（表1）。

表1 短期穩(wěn)定性-每個(gè)條件1個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（30 ng/mL））Table 1 Short term stability–1 multi-component mix(30 ng/mL) per point

1.6.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究

長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察的標(biāo)準(zhǔn)品為在六種不同溶劑中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液，共有17組（6個(gè)小瓶）。長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察條件為-20 ℃、冰箱（4 ℃）和室溫（避光或者不避光保存）。對(duì)照組溫度為-80 ℃，實(shí)驗(yàn)周期為 2、4、8、12周。對(duì)照組在最后一天取出，將混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液（10 μg/mL）混合并采用加酸或不加酸溶劑稀釋，使最終分析物濃度為 200 ng/mL。即從每一個(gè)條件下的六個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品中分別取出 20 μL到新的進(jìn)樣小瓶，然后加入 880 μL溶劑，定容至1 mL。在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)后的第二天，將不同儲(chǔ)存條件下以及對(duì)照瓶（-80 ℃）的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液取出恢復(fù)至室溫并配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行隨機(jī)序列檢測(cè)，以避免因檢測(cè)引起的任何趨勢(shì)（表2）。

表2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性-每個(gè)條件1個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（混合標(biāo)準(zhǔn)品中間儲(chǔ)備液）Table 2 Long term stability–1 intermediate mixture set per point

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用MultiQuant2.0.2軟件積分并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。用 Microsoft Excel 2013 軟件進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理。結(jié)果顯示，通過將在測(cè)試溫度下儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和在對(duì)照溫度下保存的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（短期為-20 ℃，長(zhǎng)期為-80 ℃）相除得到（公式1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 短期穩(wěn)定性研究

為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)品在液相自動(dòng)進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性，我們進(jìn)行了短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明+4 ℃下存儲(chǔ) 1～2 d是混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最佳存儲(chǔ)條件。進(jìn)一步考慮標(biāo)準(zhǔn)品溶劑發(fā)現(xiàn)加酸的溶劑相比于沒有加酸的溶劑對(duì)部分獸藥標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性影響較大。其中，青霉素、聚醚離子載體和喹諾酮類藥物（圖1，具體值見補(bǔ)充材料）明顯在沒有加酸的溶劑中更穩(wěn)定。β-內(nèi)酰胺在甲醇作為溶劑的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的穩(wěn)定性良好，這與其他作者的報(bào)道相反[4-6]。此外，所有使用中性溶劑避光保存的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液即使在室溫下也能保持較好的穩(wěn)定性（見補(bǔ)充材料），這表明當(dāng)檢測(cè)較大數(shù)量樣品時(shí)，雖然需要幾天的分析時(shí)間，但中性溶劑配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液是相對(duì)穩(wěn)定的。

圖1 所選分析物短期穩(wěn)定性研究結(jié)果Fig.1 Results of short-term stability study for selected analytes

2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究

長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究證明酸性溶劑比中性溶劑更不利于青霉素、頭孢菌素、大環(huán)內(nèi)酯、聚醚離子載體（圖2，具體值見補(bǔ)充材料）等化合物的儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青霉素只能在-20 ℃中性溶劑下儲(chǔ)存 2周，這與 Berendsen等[9]報(bào)道的“青霉素 V在甲醇中至少有2個(gè)月的穩(wěn)定性”不一致。因此，較高溫度或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存不符合青霉素的儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于?-乳胺或頭孢菌素而言，除-20 ℃以外的任何溫度下儲(chǔ)存1個(gè)月都會(huì)導(dǎo)致幾乎完全損失（90%），這與 Okerman等[10]的研究結(jié)果一致。相比之下，大多數(shù)其他化合物在-20 ℃和+4 ℃下的穩(wěn)定性良好，如磺胺類、球糖、糖皮質(zhì)激素和非甾體抗炎藥（補(bǔ)充材料）即使在室溫下和光照下也較為穩(wěn)定。以上結(jié)果表明長(zhǎng)期儲(chǔ)存青霉素、頭孢菌素和?-內(nèi)乳胺應(yīng)在-20 ℃或-80 ℃，這與Desmarchelier等[6]推薦的儲(chǔ)存條件一致。

圖2 所選分析物（補(bǔ)充材料）的長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究結(jié)果Fig.2 Results of long-term stability study for selected analytes (Supplementary material)

3 結(jié)論

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果及科研成果的可靠性，對(duì)獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液和最終混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，最終混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在+4 ℃的中性溶劑儲(chǔ)存條件下保存一周后其穩(wěn)定性良好，而且室溫下最終混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性足夠確保完成一個(gè)完整樣品序列的采集。如果獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的中間混合液需要儲(chǔ)存1個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，最好采用-20 ℃或更低的溫度。如果是包括青霉素類、頭孢菌素類和?-內(nèi)乳胺類獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間混合液在-20 ℃下儲(chǔ)存超過1個(gè)月，建議重新配制。

備注：本文的彩色圖表詳見本期PC32，也可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國(guó)知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。該論文原始數(shù)據(jù)支撐材料鏈接：https://1drv.ms/x/s!AtdxT5jN_GZ7i ymY Gy2iV0HR7Rz2