新型鴨呼腸孤病毒病研究進展

謝碧林 林志敏 林彬彬 翁漢東 王秀禎 莆田市農業科學研究所 福建莆田 351144

新型鴨呼腸孤病毒病是由一種有別于番鴨呼腸孤病毒的新型鴨源病毒引起的， 可引起番鴨、 半番鴨、麻鴨和北京鴨等水禽發病[1-5]，臨床上表現為肝臟不規則塊狀或斑狀壞死、出血性混雜、法氏囊出血以及脾臟不同程度壞死為特征的新疫病，命名為“新肝病”或“鴨出血性壞死性肝炎”。 研究表明，該病是由一種RNA 病毒引起的，該病毒分類為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬新型呼腸孤病毒[1]。 由于呼腸孤病毒的基因組屬于多節段RNA， 容易發生基因突變，出現新的致病毒株可能性大大增加，給水禽養殖業帶來新的危害。 本文對新型呼腸孤病毒病研究現狀進行梳理，綜述如下。

1 病原學

1.1 病原特性 新型鴨呼腸孤病毒直徑70 nm 左右，在電鏡下呈球形，二十面體對稱，無囊膜，雙層衣殼結構。分離毒不能凝集鴿、雞、鴨、鵝、兔、鼠和人O型紅細胞[1,6]。

該病原核酸在SDS-PAGE 電泳圖譜中具有禽呼腸孤病毒（ARV）的特征：有10 個RNA 片段，按片段大小可分為三類即大片段、中片段和小片段，分別標識為L1-L3、M1-M3、S1-S4； 其電泳圖譜與ARV相似，與MDRV 差異較大[1,6]。 L、M 和S 基因組片段分 別 表 達 λA、λB、λC、μA、μB、μNS、σC、σA、σB、σNS 等10 種蛋白，S1 基因含有三個開放閱讀框，分別表達P10、P18 和σC。 NDRV 基因組表達的蛋白中，除了μNS、P10、P18 和σNS 四種非結構蛋白外，其余的都是結構蛋白， 這些蛋白在病毒繁殖周期的各個階段具有重要的作用[7]。

1.2 理化特性 NDRV 對FUDR、氯仿等不敏感，對胰蛋白酶中度敏感， 對pH3、 紫外線、 甲醛和熱敏感[1,6]。

1.3 致病性 1 日齡雛番鴨、 雛半番鴨人工感染NDRV 分離毒后， 均能復制出與自然病例相同的臨床癥狀和病理變化。主要剖檢特征為肝臟出血壞死，心臟出血，法氏囊和腎臟出血[1,6]。分離毒對雛番鴨和雛半番鴨的致死率分別為20%～53%和13%～33%。攻毒試驗顯示， 其發病率和病死率與攻毒劑量呈正相關， 且爪墊接種攻毒較口鼻和腿肌接種攻毒更敏感；相對于雛半番鴨，雛番鴨對病毒更敏感，而雛雞和雛鵝對NDRV 不敏感[8-9]。

NDRV 分 離 株 能 在AD293、CEF、MDEF、Vero、MDCK、Marc145、ST、BHK-21 等單細胞中增殖并產生巨融合狀細胞病變， 但NDRV 分離株在PK、DF1細胞中盲傳3 代均未出現病變[9-10]。

2 流行病學

各品種鴨均可發生，且一年四季均可發病；發病日齡為5～25 日齡，大部分在5～10 日齡發病；病程5～7 d，發病率5%～15%、病死率2%～13%，感染日齡越小或并發其它疫病時，發病率和病死率會更高[1]。

林鋒強等采用分離株攻擊1 日齡雛鴨， 以研究新型鴨呼腸孤病毒在番鴨體內分布和排毒規律。 應用RT-PCR 檢測番鴨攻毒后的相關樣本，了解病原在番鴨體內分布規律。 結果顯示在攻毒后12 h，病毒在血液、脾、胸腺、肝、法氏囊中分布；攻毒后1 d在心、肺、腎、盲腸扁桃體、腦組織中分布。 攻毒后1 d 即可在喉頭和泄殖腔棉拭子中檢測到病毒核酸，而在12 d 后已不能檢出。 表明番鴨接種毒株后1 d 開始向外界排毒，12 d 后停止排毒，向外界排毒時間為PI 1 d～9 d，其中3～6 d 是排毒高峰期[11-12]。

對主要發病日齡(3～15 日齡)的番鴨進行NDRV核酸檢測，檢出率最高的是脾，可達100%，其次是肝、心和法氏囊。因此，肝、脾可作為病毒檢測和分離的首選臟器[11]。

3 病原學診斷

3.1 RT-PCR 方法 該方法是先應用反轉錄酶以RNA 為模板合成cDNA， 再以cDNA 為模板，在DNA 聚合酶作用下擴增合成獲得目的片段。 具有簡便、快速、靈敏等優點，在動物疾病臨床診斷上得到了廣泛的應用。

王劭等[13]根據NDRV-NP03 株S3 基因全序列，應用引物設計軟件， 設計合成一對特異性引物，以NDRV 分離株的RNA 為模板， 建立了一種特異性強、 靈敏度高的NDRV 檢測方法。 該方法可以從NDRV 分離毒中擴增出長度為586 bp 的特異性核酸片段，靈敏度達到2 pg 病毒RNA，可應用該檢測方法開展NDRV 的臨床診斷和流行病學調查。 孔豐等[14]參考NDRV S3 基因的保守序列設計一對引物，建立起NDRV 的RT-PCR 檢測方法，該方法能特異地從NDRV 分離毒中擴增到長度為298 bp 的核酸片段，靈敏度可達83.4 pg 病毒RNA。

3.2 多重RT-PCR 方法 多重RT-PCR 方法是在常規的RT-PCR 基礎上進行改進。 在同一RT-PCR體系中加入多對引物，同時檢測2 種以上病原核酸，它兼具快捷、高靈敏度及特異性等優點。

孫曉軍等[15]根據鴨甲肝病毒（DHAV）的3D 基因序列和新型鴨呼腸孤病毒的S3 片段，建立可區分DHAV 和NDRV 的多重RT-PCR 檢測方法。 該方法對DHAV 和NDRV 的最低檢出量均為100 copies，臨床樣品的檢測結果顯示， 該方法是一種快速鑒別診斷DHAV 和NDRV 感染的有效手段。

3.3 熒光定量RT-PCR 方法 熒光定量RT-PCR方法是在常規RT-PCR 反應體系中改良發展起來的。 該方法通過熒光信號累計實時監測RT-PCR 的整個進程，最后與已經制訂好的標準曲線比對，從而對監測對象進行定量分析的方法。 它融合了常規RT-PCR 技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜探測技術的高敏感性和定量精確等優點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量精確等優點。

丁明洋等[16]根據GenBank 中呼腸孤病毒S1 基因全序列， 設計合成一對特異性引物， 建立SYBR Green II 熒光定量PCR 檢測方法， 檢測反應在101～108copies/uL 具有良好的線性關系， 反應的檢出下限為10 copies/uL，具有較高的敏感性和特異性。 韓宏宇等[12]根據NDRV 的S1 基因序列，設計一對特異性引物，建立了基于SYBR Green I 的實時熒光定量RT-PCR 檢測方法，敏感性試驗顯示，該方法最低可檢出15 copies 的病毒cDNA， 其病毒最低檢出量為0.5 TCID50，具有良好的特異性和重復性。

3.4 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術（LAMP）能在等溫（60～65 ℃）條件下，短時間內（通常是1 h 內）進行核酸擴增。 與常規PCR 相比，不需要模板的熱變性、 溫度梯度循環、 電泳及紫外觀察等過程，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴增方法。

蔡躍佳等[17]針對新型鴨呼腸孤病毒保守序列設計特異性引物， 將RT-LAMP 技術與熒光染料鈣黃綠素結合， 建立NDRV 鈣黃綠素可視化RT-LAMP快速檢測方法，并對該方法的反應溫度、時間及體系進行優化。該方法可特異性檢測出NDRV，最低檢測限約為200 fg，且讀取結果方便、直觀。 于可響等[18]基于NDRV S3 基因的6 個保守區域設計4 條LAMP 引物，建立一步反轉錄環介導等溫擴增（RTLAMP） 方法， 該方法具有良好的特異性， 對病毒RNA 的最低檢出量為0.1 pg，是常規RT-PCR 方法的100 倍，適于基層實驗室快速檢測。

4 血清學診斷

王錦祥等[19]為建立快速檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體的方法， 以純化的重組σC 蛋白作為包被抗原，并對該方法的反應條件進行優化，建立了NDRV間接ELISA 抗體檢測方法。該方法僅對NDRV 血清檢測為陽性，具有良好的特異性；其批內和批間重復性試驗的變異系數均小于5%，具有良好的重復性。利用建立的σC 蛋白間接ELISA 方法對80 份疑似鴨血清樣品進行檢測，結果顯示與NDRV 全病毒間接ELISA 的符合率為88.75%。 該ELISA 方法為NDRV 的流行病學調查提供了快速、 特異的血清學檢測方法。之后，王錦祥等[20]對以上檢測方法進行優化，增加NDRV NP03 株的重組σB 蛋白作為包被抗原， 重新建立檢測該病抗體的間接ELISA 方法，與NDRV 全病毒間接ELISA 相比較， 符合率高達92.5%，進一步豐富了該病抗體的檢測方法。

陳海鵬[21]利用pET-28a 原核表達系統成功地表達了新型呼腸孤病毒σC 蛋白并純化， 用純化后的σC 蛋白作為包被抗原， 建立了具有良好特異性、重復性和敏感性的N-MDRV 間接ELISA 檢測方法。對臨床送檢的血清樣品進行檢測， 檢出率達到98.5%。

Yun T 等[22]克隆NDRV 的外衣殼（σC）并作為包衣抗原建立一種高靈敏度、 特異性間接酶聯免疫吸附試驗 （ELISA） 方法檢測抗體， 可用于大規模的NDRV 感染血清學調查和抗體滴度監測。

5 防治措施

5.1 滅活疫苗 滅活苗是指先對病原進行培養，然后用加熱或化學劑(通常是福爾馬林)將其滅活，但仍保留其免疫原性， 注射后能使動物產生針對該病原的特異抵抗力。

陳仕龍等[23-24]以NDRV JM85 株為種毒研制安全、有效的油佐劑滅活苗，并通過免疫血清學檢測及攻毒保護試驗評價疫苗效果。結果顯示，麻鴨二免后28 d 能夠產生較高的中和抗體， 并能較長時間維持，且其子代雛鴨體內具有一定的母源抗體，能夠抵抗強毒的攻擊。 該疫苗可用于防控鴨新型呼腸孤病毒病。為了提升該病滅活苗的免疫效果，陳仕龍等采用透析的辦法對病毒尿囊液中抗原進行濃縮， 提高了抗原濃度。 分別采用病毒尿囊液和濃縮后病毒尿囊液為抗原研制濃縮疫苗， 開展兩者免疫原性對比試驗。 通過對比得知，濃縮疫苗安全性好、免疫效果好；濃縮疫苗免疫雛鴨后的免疫保護性達100%。 表明濃縮疫苗安全、高效，在雛鴨上具有良好的免疫保護效果，具有良好的市場前景。

5.2 重組載體疫苗 重組載體疫苗是將病原體中可編譯有效免疫原的基因片段通過生物技術手段插入載體基因組中， 接種后隨含有該重組載體的疫苗株在體內不斷增殖， 實現該有效抗原在體內表達的目標。

Zhu Y 等[25]為研制新型鴨呼腸孤病毒病疫苗，將NDRV 的σC 基因克隆到塞姆利基森林病毒(SFV)復制子載體pSCA1 中，構建了一種基于該復制子的自殺性DNA 疫苗，并對其進行評價。 結果表明，雛鴨可誘導產生特異性抗體、中和抗體、IFN-γ和IL-4。 此外，所有雛鴨都受到NDRV 野毒攻擊的保護。

5.3 重組亞單位疫苗 重組亞單位疫苗是指將保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達， 并以基因產物-蛋白質或多肽制成疫苗。

梅敏敏等[26]根據NDRV XX 株σB 基因編碼序列構建原核表達載體， 成功表達出約55 kU 的融合蛋白。 經Ni2+柱親和層析純化獲得可溶性重組蛋白，經Western blotting 和蛋白質譜鑒定為高純度的σB重組蛋白。 NDRV σB 蛋白的成功表達，為其功能的深入研究及基因工程疫苗的研發奠定了基礎。

畢莊莉[27]用大腸桿菌原核表達系統和桿狀病毒真核表達系統分別表達了NDRV （NDRV TH11 株）σC 蛋白，獲得的蛋白具有良好的免疫原性。 應用桿狀病毒表達的σC 蛋白制備疫苗，免疫1 周齡雛鴨，免疫2 周后使用NDRV 強毒進行攻擊，發現免疫組得到良好的保護性，保護率可達70%。 該蛋白可為后期研制有效的新型鴨呼腸孤病毒病疫苗提供了基礎。

Bi Z 等[28]構建了含有NDRV σC 基因的重組桿狀病毒，純化后的蛋白作為亞單位疫苗的抗原。根據體液免疫反應、細胞免疫反應和對NDRV 攻毒的免疫保護來評估σC 疫苗的療效。 結果表明， 用重組σC 蛋白免疫的所有雛鴨均能產生較強的體液免疫和細胞免疫反應。此外，還觀察到免疫后的雛鴨對致死劑量NDRV TH11 菌株攻毒的100%保護。結果顯示，重組σC 蛋白可以作為疫苗的候選蛋白。

6 致病機制

Xiao R 等[29]利用共免疫沉淀法、GST pull-down試驗和共聚焦顯微鏡研究σC 與宿主的易位相關膜蛋白1（TRAM1）之間的相互作用，分別通過RNA 干擾敲除TRAM1 基因和過表達TRAM1 基因， 探討σC 對病毒復制的影響。結果表明，TRAM1 沉默有利于抑制病毒復制， 證實TRAM1 在NDRV 感染中的重要作用。

Chen X 等[30]對3 日齡雛鴨接種NDRV NP03 株和注射無菌Hank's 溶液以比較雛鴨盲腸內的微生物菌群情況，結果顯示，相對于對照組，接種NDRV NP03 株的試驗組雛鴨腸道細菌的相對豐度發生變化， 尤其是瘤胃球菌科和毛螺旋菌科的細菌顯著減少，而志賀氏桿菌明顯增多。 所以，番鴨感染NDRV可導致腸道菌群改變， 包括益生菌凈損失與致病菌代償性擴張，這些結果為NDRV 的潛在致病機制提供了新的見解。

7 小結與展望

當前， 對新型呼腸孤病毒的研究報道主要集中在NDRV 的小片段基因上， 關于σC、σB 蛋白的研究相對比較深入，而NDRV 致病機制方面的研究報道相對較少。

目前認為呼腸孤病毒σC 蛋白在病毒致病機制上具有多重功能，且該蛋白是NDRV 唯一能與宿主細胞吸附的蛋白， 為病毒入侵細胞提供前提條件[31-34]。σC 蛋白攜帶有特異性中和反應的表面抗原，能夠產生中和抗體， 該蛋白將是研制亞單位疫苗的候選蛋白。 由于呼腸孤病毒科的核酸屬于多節段基因， 以及RNA 聚合酶缺乏矯正功能， 導致病毒容易發生基因重組或抗原變異， 產生新的致病性菌株[35-36]，呼腸孤病毒的這個特性為研制有效的疫苗提出了挑戰。 Du X 等[37]研制了一種具有廣譜抗病毒活性的金絲桃素（HY）與具有高載藥量和低細胞毒性的氧化石墨烯（GO）復合物，并研究該復合物（GO/HY） 在DF-1 細胞和NDRV TH11 株感染雛鴨體內的抗病毒活性。 結果提示GO/HY 對NDRV 具有體內外抗病毒活性， 為開發新型呼腸孤病毒病新療法提供新的探索。由于抗生素對病毒無治療作用，應用疫苗預防該病毒的侵襲是最為經濟有效的做法，研制安全、高效的疫苗仍然是當前的研究重點。完善的NDRV 致病機制研究將在分子生物學水平上預防治療新型呼腸孤病毒病成為可能。