乳腺癌組織中長鏈非編碼RNA-00707的表達及與分子病理分型的相關性

趙麗華，李 靜，位 嘉，林秋蘭

乳腺癌已成為全球最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥的主要死因，發病率有逐年增高且呈年輕化趨勢。隨著分子生物學技術的發展，發現長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, LncRNAs)的表達異常可能與乳腺癌有關，因此對LncRNA的進一步分析可為乳腺癌診療提供新思路[1]。本實驗以既往建立的間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)與乳腺癌細胞MCF7共培養模型為分析對象，在模擬腫瘤微環境的條件下分析腫瘤細胞轉錄組的動態變化，目的是尋找與促進乳腺癌進展、轉移相關的關鍵LncRNA，探索其發揮作用的可能機制。在此基礎上應用RNAscope技術檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中長鏈非編碼RNA-00707(long-chain non-coding RNA-00707, Linc00707)的表達水平，并結合乳腺癌分子病理分型，初步探討Linc00707在乳腺癌診斷、預后的意義。

1 材料與方法

1.1 Linc00707的獲取本課題團隊前期試驗建立的人源脂肪間充質干細胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)與人乳腺癌MCF7細胞系細胞間接共培養體系，并誘導MCF7細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)，lncRNAs芯片技術獲得一批差異表達的lncRNAs，并通過qRT-PCR驗證，最終得到差異性表達的長鏈非編碼RNA，命名為Linc00707[2]。

1.2 乳腺癌標本收集2015～2019年民航總醫院病理科及衡道病理中心存檔的石蠟包埋樣本136例，癌旁正常乳腺組織78例。所有患者均為女性，年齡31～72歲，中位年齡41.2歲。依據2011年St.Gallen共識，乳腺癌分子病理分型分為4型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和基底樣型[3]。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用羅氏BenchMark GX全自動免疫組化染色系統，一抗ER(SP1)、PR(1E2)、HER-2(4B5)、Ki-67(30-9)均購自羅氏公司，CK14(MAB-0169)和EGFR(RMA-0688)購自福州邁新公司。

1.3.2組織芯片的制作 136例乳腺癌組織及78例癌旁正常乳腺組織由經驗豐富的病理專家選擇組織區，由有經驗的技術人員參照文獻[4]制作組織微陣列。

1.3.3RNAscope技術[5]采用RNAscope2.5HD檢測試劑盒(美國ACD公司)檢測Linc00707 mRNA的表達，主要步驟：標本制備，蛋白酶加處理，探針雜交，信號放大，DAB顯色，蘇木精復染。

1.3.4Linc00707顯微鏡下計數 參照HER-2 RNAscope染色分級計數方法[6]，于40倍物鏡下計數100個癌細胞，RNA轉錄物在癌細胞核和細胞質內形成明顯的點狀或團簇狀信號，平均每個細胞中<1個信號為0分；1～3個信號為1分；4～9個信號及無/少量呈簇狀信號為2分；10～15個信號為3分(若<10%瘤細胞中的信號呈簇狀也歸為此類)；>15個信號為4分(若>10%瘤細胞中的信號呈簇狀也歸為此類)。

1.4 統計學分析采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計學分析，免疫組化和RNAscope結果采用χ2檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中Linc00707的表達136例乳腺癌中121例Linc00707陽性，1分占9.1%(11/121)，2分占30.6%(37/121)，3分占40.4%(49/121)，4分占19.8%(24/121)(圖1)。Linc00707在乳腺癌組織中的陽性率(89%，121/136))高于癌旁正常乳腺組織(3.8%，3/78)，差異有統計學意義(χ2=147.40，P<0.05)。

2.2 乳腺癌中Linc00707表達與分子病理分型的相關性根據免疫組化結果分型，其中Luminal A型19例，Luminal B型52例，基底樣型26例，HER-2過表達型39例。χ2檢驗結果顯示，Linc00707在乳腺癌病理分子亞型中的陽性率分別為Luminal A型52.6%(10/19)，Luminal B型98.1%(51/52)，基底樣型88.5%(23/26)，HER-2過表達型94.9%(37/39)，Luminal B型、HER-2過表達型、基底樣型中的陽性率高于Luminal A型(χ2=20.143、7.207、12.211，P<0.05，圖2)。

3 討論

浸潤性乳腺癌是一組異質性極強的腫瘤，有各自不同的分子病理學特征和臨床生物學行為，運用基因表達譜將乳腺癌劃分為4種分子亞型，這些乳腺癌亞型具有不同的臨床表現，對新輔助化療的反應性和危險因素也各不相同，乳腺癌患者的臨床治療也變得更加具體和個性化，越來越多的機制研究使個體化治療成為可能，使患者的預后更好[7]。

LncRNAs是指轉錄長度大于200個核苷酸并且不翻譯成蛋白質的功能性RNA分子[8]。其最初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，并無生物學功能。近年研究表明LncRNA參與基因組印記、X染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的生理過程，LncRNA表達異常可能與腫瘤發生、發展、轉移和預后密切相關，已成為當前腫瘤研究的新熱點[9]。目前已鑒定出HOTAIR、NKILA、GAS5等近10種乳腺癌相關LncRNA，這些LncRNA可通過調控表觀遺傳修飾和關鍵細胞信號轉導途徑，影響乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等重要生物學作用，參與乳腺癌惡性進展。因此深入探究LncRNA有望為乳腺癌診斷和治療提供新的分子標志物[10]。

本實驗應用hAD-MSCs與MCF7細胞共培養，發生EMT化的MCF7細胞與正常MCF7細胞進行LncRNAs芯片分析，并通過qRT-PCR驗證，最終得到差異性表達的Linc00707，應用RNAscope技術檢測Linc00707在乳腺癌組織中的表達及與分子病理分型的相關性，RNAscope是近年開發的一種新型RNA原位雜交技術，基于其獨特的探針設計與背景抑制技術，使單個RNA的轉錄變得可視化，是目前最精準的RNA檢測技術，該技術有三個特點：(1)可以對常規存檔的石蠟組織、冷凍組織等進行檢測，方便進行回顧性分析；(2)在保留組織形態學信息的基礎上進行RNA的精確定量；(3)無需抗體，尤其適合低水平表達的RNA[11]。

為節省實驗成本并提高效率，本實驗把數十個至數百個患者的組織整齊有序的排列到同一蠟塊上，制成組織芯片。其最大的作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態學相結合，應用同一實驗條件同時觀察大量不同患者組織樣本(高通量)，減少實驗誤差，使實驗結果更可靠，并節約實驗成本和人力。本實驗結果顯示，Linc00707在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常乳腺組織，表明Linc00707在某種程度上可以促進乳腺癌細胞的增殖，與體外實驗研究Linc00707可以促進MCF7細胞的侵襲和轉移能力的結果符合，在Linc00707陽性的分級計數中2分(30.6%)、3分(40.4%)和4分(19.8%)表達高于1分(9.1%)病例，初步顯示Linc00707可提示腫瘤細胞的生長活性，可以作為判斷乳腺癌的增殖指標之一。

病理形態相同的乳腺癌，由于分子遺傳學的改變，在分子水平上呈現高度異質性，導致患者預后及治療的反應差異較大，激素受體陽性患者預后佳，如Luminal A型、Luminal B型，HER-2是一個預后差的指標，HER-2過表達型預后比Luminal A型及Luminal B型差，基底樣型乳腺癌預后最差[12]。應用乳腺癌分子分型分析在某種程度上與患者預后及生存期有相關性，有研究顯示，HER-2過表達型與基底樣型的局部復發率分別為33.3%和14.8%，遠處轉移率分別為55.6%和40.7%，均高于其他兩種亞型，HER-2過表達型與基底樣型的中位無瘤生存期較短，HER-2過表達型和基底樣型乳腺癌的病理學特征較差，且預后不良，而Luminal A型預后較好。本實驗通過乳腺癌的分子分型分析顯示，Linc00707在Luminal B型、HER-2過表達型、基底樣型中的表達明顯高于Luminal A型，結果表明Linc00707在惡性程度相對高的亞型中表達明顯增高，初步提示Linc00707可以促進乳腺癌的發展，對乳腺癌的惡性程度評估有一定的臨床意義及成為新的乳腺癌標志物具有潛在價值的可能性，對乳腺癌的治療及預后起到一定的輔助作用，并有利于選擇和研究更具針對性的個性化治療方法。

(本實驗獲丁華野教授的鼎立支持，特此致謝！)