動物細胞骨架微絲標記與觀察綜合性實驗的探索*

李奇志 楊業秋 夏 姝 楊建國

（1 華中科技大學生命科學與技術學院，國家級生命科學與技術虛擬仿真實驗教學中心 湖北武漢 430074 2 江漢大學醫學院 湖北武漢 430056 3 武漢大學中南醫院心胸外科 湖北武漢 430070）

細胞骨架是指真核細胞質中的蛋白質纖維網架體系，它對于細胞的形狀、細胞的運動、細胞內物質的運輸、染色體的分離和細胞分裂等起著重要的作用。細胞骨架由微管、微絲和中間纖維組成。其中,由肌動蛋白組成的微絲是真核細胞中含量最豐富的一種蛋白復合體，其動態變化在細胞遷移、胞質分裂、囊泡運輸、細胞吞噬等多個過程中發揮至關重要的作用［1－3］。

在細胞生物學本科教學中，細胞骨架往往成為講解研究技術等的示例,實驗教學中更是入選率最高的實驗內容［4］。傳統的實驗教學多選用“考馬斯亮藍染色標記細胞骨架實驗”即采用非特異方法顯示洋蔥細胞內的微絲束。該實驗在一定程度上可幫助學生加深對細胞骨架的認識，并了解染色方法和步驟，但存在諸多缺陷，例如，考馬斯亮藍染色法不能對特異性地區分細胞骨架的具體組分。華中科技大學生命科學與技術學院以當前較先進的實驗技術為基石，設計了動物細胞骨架微絲標記的綜合性實驗，在實驗設計中考慮到醫學生的專業特點，將實驗材料洋蔥內皮細胞換成體外培養的動物細胞。保留非特異性蛋白質染料考馬斯亮藍染色的同時，增加了用特異性熒光標記的鬼筆環肽熒光探針染色肌動蛋白，并用細胞松弛素B 處理細胞后觀察微絲的變化。

（E-mail: zhangji@nwnu.edu.cn）

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝母細胞瘤HepG2（以下簡稱HepG2）細胞系由華中科技大學生命科學與技術學院基因工程和基因組學聯合實驗室捐贈、大鼠神經膠質瘤細胞C6（以下簡稱C6）細胞系由武漢大學中南醫院心胸外科教研室捐贈、SD 大鼠新生乳鼠（購于湖北省疾控中心）原代培養細胞（所有動物實驗操作均符合華中科技大學實驗動物倫理委員會有關條例規定）。

1.2 試劑和儀器 DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶和胎牛血清購自HyClone 公司；細胞松弛素B、DAPI、FITC 標記的鬼筆環肽和Cy3 標記的鬼筆環肽購自南京凱基生物公司；新生小牛血清和胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

6 cm 培養皿（Gibco 公司）、CO2細胞培養箱（ESCO，CCL-170B-8-NF）、倒置顯微鏡（Nikon，TS-100）、熒光顯微鏡（Nikon，Ni-U）。

1.3 動物細胞系傳代培養 將HepG2 細胞系按104～105個／mL 濃度接種在6 cm 的培養皿中，每個培養皿中加入2 mL 的含8%小牛血清的高糖DMEM 培養基，輕輕吹打使細胞分散均勻，再加入一定體積的上述完全培養基使終體積達到5 mL，在每個培養皿中放入3 片無菌蓋玻片（經160℃、2 h 干烤滅菌）作為細胞爬片；培養皿放入37℃、5% CO2濕化培養箱中培養。

C6 細胞系的完全培養基是含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，操作步驟同上。

1.4 動物細胞原代培養 無菌條件下取大鼠乳鼠皮膚約2 cm2，置于培養皿中，用0.01 mol／L PBS 反復洗滌后,剪成1～2 mm2的小塊，0.25%胰蛋白酶中37℃水浴30 min，800 r／min 離心10 min后，以1×105個／mL 細胞接種于6 cm 的培養皿，培養皿中加入含8%小牛血清的高糖DMEM 培養基，并放入無菌蓋玻片作為細胞爬片；培養皿在37℃、5% CO2濕化培養箱中培養。

1.5 考馬斯亮蘭染色法 考馬斯亮藍R250 顯示細胞內微絲的方法［5］：吸去培養皿中陳舊的培養基，用0.01 mol／L PBS 洗滌培養皿中長有細胞的爬片后，1% Triton X-100 37 ℃處理30 min，M 緩沖液洗滌細胞爬片，在3 %戊二醇中固定10 min，以0.01 mol／L PBS 洗滌，用濾紙吸去多余液體，0.2%考馬斯亮藍R250 染色15 min，PBS 洗滌,最后將細胞爬片倒置于載玻片上用PBS 液封片并鏡下觀察。

1.6 FITC-鬼筆環肽熒光標記法［6］大鼠乳鼠原代細胞骨架微絲的熒光染色具體步驟如下：吸去培養皿中陳舊的培養基，用0.01 mol／L PBS 洗滌培養皿中長有細胞的爬片后，3.7%甲醛固定10 min，PBS 洗3 次，每次5 min；0.1% Triton X-100 透化處理15 min，PBS 洗滌；FITC 標記的鬼筆環肽室溫避光反應40 min；PBS 洗去未結合的熒光染料，最后，用甘油封片將細胞爬片倒扣置于載玻片上并鏡下觀察。

1.7 熒光標記的鬼筆環肽和DAPI 分別標記體外培養細胞 HepG2 細胞骨架微絲和細胞核的熒光染色具體步驟如下：吸去培養皿中陳舊的培養基，經0.01 mol／L PBS 洗滌培養皿中長有細胞的爬片后，4%的多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100室溫處理5 min，1%的BSA 孵育30 min 后，用5U Cy3 標記的鬼筆環肽于室溫暗處理20 min，并100 ng／mL 的DAPI，室溫暗處理5 min。PBS 清洗細胞和細胞封片同1.6。

大鼠乳鼠原代細胞骨架微絲的熒光染色同1.6，細胞核熒光染色用100 ng／mL 的DAPI，室溫暗處理5 min，PBS 清洗細胞和細胞封片同1.6。

1.8 細胞松弛素B 處理HepG2 細胞 在培養的HepG2 細胞培養皿中加入1 mg／mL（DMSO 配制）的細胞松弛素B 溶液，使終濃度為10 μg／mL，37℃培養箱中孵育30 min，對照組細胞相應用等量生理鹽水和DMSO 處理［7］，實驗組和對照組都在15 min 和30 min 后進行考馬斯亮藍染色。將細胞松弛素B 處理過的細胞爬片用PBS 液洗細胞5 次后，繼續培養90 min 后進行考馬斯亮藍染色并觀察。

2 結果

2.1 HepG2、C6 細胞系和原代細胞考馬斯亮藍R250 染色（圖1）

圖1 經典方法考馬斯亮藍染液將微絲被染成藍色

2.2 熒光探針標記原代培養細胞（圖2）

圖2 FITC-鬼筆環肽標記的肌動蛋白在熒光顯微鏡下發出綠色熒光

2.3 雙熒光探針標記體外培養的原代大鼠皮膚細胞和HepG2 細胞系（圖3）

圖3 細胞的肌動蛋白和細胞核分別被鬼筆環肽和DAPI 熒光探針標記

2.4 細胞松弛素B 處理細胞前、后微絲的變化和細胞形態學改變（圖4）

圖4 細胞松弛素B 處理前后HepG2 細胞微絲和細胞形態的變化

3 實驗教學探討

3.1 細胞骨架標記方法的優、缺點比較 在本教學中用2 種方法標記細胞骨架微絲：考馬斯亮藍染色法和鬼筆環肽標記法標記法。考馬斯亮藍R250染色法具有成本低、可用普通光學顯微鏡觀察結果的優點；考馬斯亮藍R250 可染各種蛋白，并非特異染微絲，不能區分骨架蛋白的成分；但在該實驗條件下，微管結構不穩定，有些類型的纖維太細，光學顯微鏡下無法分辨，因此，觀察到的主要是由微絲組成的直徑約40 nm 應力纖維（圖1、圖4）。鬼筆環肽標記法中鬼筆環肽與肌動蛋白結合，能特異顯示微絲并且靈敏度極高（圖2、圖3）；該方法在處理細胞時用的固定和通透細胞膜沒有完全去除細胞膜及其他非骨架成分，維持了骨架形態的完整性，相對真實地反映了骨架的自然狀態，也是科學研究的主流方法之一；但由于需要與熒光素結合，觀察結果時需要熒光顯微鏡，且價格相對比較貴，因此在實驗教學有時會受到限制。

3.2 根據學情背景不同的教學設計 華中科技大學生命學院每年承擔同濟基礎醫學院9 個專業20多個班級的本科生、臨床醫學8年制及留學生MBBS（Bachelor of Medicine ＆ Bachelor of Surgery）的醫學細胞生物學實驗教學；同時每年還有生物技術、生物信息和生物科學近10 個班細胞生物學實驗教學任務。根據各專業特點開設高質量有專業特色的實驗課程是學院課程改革探索的主要重點，該實驗項目就是在這樣的改革背景下探索實施的。實驗內容涉及細胞培養和細胞熒光標記技術，根據各專業的特點在多方面進行了實驗優化。例如，細胞培養內容的選擇是根據專業特點不同而不同。細胞培養作為細胞生物學實驗中最具有代表性的技術，其關鍵在于無菌操作。因此，根據無菌操作的難易程度，將操作步驟復雜、過程繁多的動物細胞原代培養安排在臨床醫學8年制的實驗中；而臨床醫學5年制、預防醫學等專業選擇操作相對簡單的傳代細胞培養，并且選用體積較大、鋪展較好、貼壁牢固的HepG2 或HeLa 細胞系；臨床醫學6年制選用操作動作要求更加輕柔的C6細胞系；對生物學專業的學生，由于他們比醫學生高一年級（醫學生和生物學專業學生分別是第2 學期和第3 學期學習細胞生物學的課程）同時動手能力也較強，因此，在實驗中將這幾種細胞按學生分組全部分配給各組學生培養。教師在上課時展示不同的專業學生培養細胞的結果，探討不同細胞內微絲的分布特征、微絲的數量及構型在細胞之間的差異，使學生對微絲的理解更加深入和全面，知識面得到很大的拓展。

實驗設計還必需考慮由于實驗學生人數多會造成實驗安全性難以把控、實驗者的參與熱情和實驗的成功率受到影響，因此，選擇適合于學生當前學情的實驗材料不僅可增加實驗的成功率,而且可增加學生的科研訓練機會,使學生獲得成就感,增加學習的興趣和自信心。筆者對實驗材料進行如下改進。首先，對用于細胞爬片的蓋玻片的滅菌方法進行了改進。改進前常規將蓋玻片浸泡在醫用酒精里，細胞培養接種細胞時將泡在酒精里的蓋玻片在酒精燈上燒后再置于培養皿里做細胞爬片。這種方法在操作者不熟練時容易發生起火的安全事故，而且蓋玻片在酒精燈上燒的時間不長，在培養時間長達1 周時這種滅菌效果并不理想。因此改進方法是將做細胞爬片的蓋玻片在干烤箱里160℃、2 h 滅菌處理，這樣既避免了沾有酒精的蓋玻片在酒精燈上燒也保證了滅菌效果。其次，實驗中將常規用多孔板傳代細胞換成每位學生用一個6 cm 的培養皿，在教學中教師講述粘附細胞生長的特點。粘附細胞在蓋玻片上、下面都能貼壁生長，貼附在蓋玻片上面的細胞比下面的生長得更快、更好，鼓勵學生大膽同時仔細地將2～3 片滅菌蓋玻片放在培養皿中，盡量不要重合，即使有重合對實驗結果不會有大的影響。這樣的實驗設計既增加了學生的操作機會，學生也更能理解培養細胞的生長特點，同時還能避免多位學生用一塊多孔板可能造成的交叉污染。最后，教學中將學生細胞培養所用的培養基、PBS 和胰蛋白酶等都換成小包裝，例如，培養基和PBS 裝在可重復利用的10 mL 離心管中，胰蛋白酶裝在1.5 mL的EP 管中，每班學生利用課余時間分裝這些試劑。這樣在很大程度上避免了眾多學生參與的細胞培養可能出現的交叉污染，而且能保證每個學生的實驗結果都是用自己的材料完成，學生更能獲得成就感。

3.3 在實驗內容的安排上體現綜合實驗設計思想 目前，大多數高校本科細胞生物學實驗教學每個專業每周開設1 次課，時長為4 學時。學生無法持續地進行實驗，因此，實驗內容的安排盡量選擇能單獨設課同時又彼此銜接。基于此，筆者設計出2 個有機聯系且逐步遞進的實驗階段,讓學生能從細胞培養、細胞骨架微絲標記及觀察入手,逐步了解細胞骨架微絲在生長過程中的形態表現。第1 階段進行的是4 學時的動物細胞培養實驗內容，實驗教學時教師將培養至對數生長期的細胞提供給學生，按每班2 人一組提供3.5 cm 培養皿作為母瓶細胞。該階段的教學重點在于無菌操作技術、細胞計數和死活細胞的鑒定。學生需在細胞培養室內每2 人一組進行無菌操作,并按照教師要求的濃度進行細胞計數，每位學生都要將細胞接種在6 cm 的培養皿中，無菌的蓋玻片也是學生在接種細胞過程中自己置于培養皿中作為爬片細胞。這樣既能保證在下一周第2 階段4 學時實驗課細胞的密度，同時，學生又能用自己培養的細胞爬片做細胞骨架微絲標記實驗。第2 階段的實驗內容是對培養細胞的細胞骨架微絲進行標記后，在普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡下進行觀察，該階段教學的重點和難點在于熒光標記和利用熒光顯微鏡的使用。2 個部分的教學實驗涵蓋了細胞培養、細胞計數、熒光標記和熒光顯微鏡檢測技術等內容。這種實驗內容有機編排和設計增強了學生的學習興趣和對科學實驗系統性和嚴謹性的認識，又能使學生體會到實驗具有高度的連貫性和整體性，極大地提高了學習興趣和積極性。

3.4 科學前沿性和綜合研究性 該實驗項目涉及熒光顯微鏡技術和藥物對培養細胞的影響。熒光顯微鏡不僅是生命學科不可缺少的研究工具，也是多學科發展的綜合成果，所涉及的物理學和電子學理論知識深奧繁瑣。因此，顯微技術實驗教學的內容設計應盡量讓學生在有限的課堂時間里形象、直觀地學習和掌握這門技術。筆者在實驗教學中調整并增加了需要使用熒光顯微鏡的內容，學生2 人一組選擇實驗內容進行制片與觀察,這樣極大提高了使用熒光顯微鏡的機會。本實驗教學選用FITC 和Cy3 2 種最常用的熒光素標記的鬼筆環肽，FITC 和Cy3 在相應的激發光下分別發出綠色和紅色熒光；同時也用DAPI 標記了細胞核，DAPI 在紫外激發光下發出藍色熒光（圖3）。這樣的實驗設計讓學生熟悉熒光顯微鏡激發光與熒光波長的關系、濾光片的選擇方法。學生在觀察到色彩斑斕的細胞世界同時，也能了解熒光顯微鏡的設計原理、結構功能及使用方法，同時避免讓學生僅停留于感性認識階段，能讓學生體驗到科技創新成果的優越性和現實存在，還能掌握熒光顯微鏡數字成像系統采集和處理分析圖像等技能，為后期實驗教學和科學研究奠定基礎。

實驗所用的試劑鬼筆環肽和細胞松弛素B 是研究微絲骨架最常用的藥物。鬼筆環肽是一種從有毒菌中提取的真菌毒素［6］。鬼筆環肽可特異性與絲狀肌動蛋白結合，用熒光標記的鬼筆環肽染色技術是近年來研究固定細胞微絲骨架的傳統技術手段，應用這些技術已使得科學家在微絲骨架的研究方面取得了很大進展［8-9］。細胞松弛素B 作為第1 個用于研究細胞骨架的藥物，主要作用是促進肌動蛋白絲的解聚及抑制單體肌動蛋白聚集［10-11］。細胞松弛素為真菌的代謝產物,可與微絲正端結合,抑制其聚合,導致微絲解聚,并能抑制各種依賴于微絲的運動,具有抗腫瘤的潛能［3］。在本實驗項目中用細胞松弛素B 處理HepG2 細胞，微絲解聚后，鏡下觀察細胞形態是否皺縮；再用緩沖液洗脫細胞松弛素B 后繼續置于培養箱中培養，鏡下觀察細胞形態是否恢復，如實驗結果中圖4所示。學生完成整個實驗過程也是對教材細胞骨架運動形態的模型“人工再現”，并且對微絲構成細胞支架、維持細胞形態的功能理解得更加深刻。通過這樣設計的實驗教學改革，讓學生了解和掌握高新技術，在一定程度上增強其對科學研究和創新的信心。同時提高了學生的學習興趣和積極性，加深了對細胞生物學進展相關內容的理解和掌握，培養了學生的創造性思維能力，發揮主觀能動性，提高學習效率。