基于高壓靜電場處理的櫻桃番茄果實貯藏期生理品質及其代謝

楊智超，曹 陽，沈超怡，孫崇德，吳 迪,*

（1.浙江大學農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學新農村發展研究院，浙江 杭州 310058）

番茄（Solanum lycopersicumL.）又稱西紅柿，含有豐富的維生素、礦物質、酸類和糖類等營養物質，經常食用能提高人體免疫力[1-3]。櫻桃番茄是番茄大家族的重要成員，在我國的種植面積不斷擴大[4]。櫻桃番茄皮薄多汁，成熟后會迅速軟化，貯運過程容易腐爛，造成品質下降[5]；同時由于櫻桃番茄常被鮮食，其表面的食源性致病菌過多容易引發食源性疾病[6-7]。因此，減少櫻桃番茄果實采后腐爛和降低果實表面微生物數量非常重要。

高壓靜電場（high voltage electrostatic field，HVEF）是指在單位距離上通過穩定的高壓作用而形成的一種靜電場[8]。HVEF處理可以通過多種方式實現果蔬保鮮[9-10]，主要包括：1）改變果實的電場能；2）電離空氣中的氧氣形成臭氧；3）影響果實細胞膜的離子通透性；4）改變果蔬酶活性；5）破壞乙烯和有關揮發性物質；6）去除空氣傳播的真菌孢子；7）在貯存環境中產生和釋放空氣負離子和其他活性物質。由于HVEF處理只涉及物理過程，無化學藥物殘留，因此是一種綠色的殺菌保鮮方法[11]。并且與傳統高溫殺菌相比，HVEF處理不產生高溫，能更好地保留果蔬中的營養成分，并且具有耗能低的優勢。因此，HVEF在果蔬等食品殺菌中有著廣闊的應用前景[12]。

此前研究發現，HVEF處理會引起生物體內的酶活性變化，從而影響一系列代謝功能[9]。已有學者研究了不同果蔬經HVEF處理后的品質變化，包括蘋果[13]、芒果[14]、柿子[15]、柑橘[16]、梨[17]等。代謝組學是研究生物系統對生物刺激或遺傳信息改變的整體動態代謝反應，理解復雜多細胞系統中隨時間的系統變化，尋求對復雜生物樣本代謝進行分析描述的一門學科[18]。由于代謝物能將基因和蛋白表達的微小變化進行體現與放大，因此，通過代謝組學分析既可發現生物體在受到各種內外環境擾動后的不同應答，也可以區分同種不同個體之間的表型差異[19]。

本實驗以新鮮‘黃妃’櫻桃番茄為材料，以表面腐爛率、大腸桿菌菌落總數、乙烯釋放量、呼吸速率、質量損失率等為評價指標，研究了在不同電場強度和不同處理時間下HVEF處理對櫻桃番茄采后貯藏保鮮的影響；同時對HVEF處理后的櫻桃番茄果實進行代謝組學分析，探究其代謝產物在處理后的含量差異和變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘黃妃’櫻桃番茄購于湖州南潯慶豐園農場，挑選大小一致、無病蟲害的櫻桃番茄若干，30 min內運送至浙江大學紫金港校區實驗室；大腸桿菌O157:H7（菌種編號：ATCC25922） 上海生物保藏中心。

伊紅美藍（eosin-methylene blue，EMB）培養基浙江格陵設備科技有限公司；氯化鈉 浙江同力信息科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZJU-GYJD-001型高壓靜電場試驗儀器為浙江大學自主研發，包括控制臺、高壓靜電電源（電壓范圍為0～90 kV）和果實處理裝置（電場強度范圍為0～1 800 kV/m）。其中，果實處理裝置為帶卡槽的絕緣支架組成的密閉箱體，通過調節高低壓電極板的距離，可形成不同的電場強度。

BSA2202S電子天平 德國Sartorius公司；Research plus移液槍 德國Eppendorf公司；HZ-9210K搖床天津華立達公司；7980氣相色譜儀 美國Agilent公司；CheckPoint II便攜式O2/CO2測定儀 美國MOCON Europe A/S公司；Scientz-100F凍干機 寧波新芝生物科技股份有限公司；MM400 Retsch研磨儀 德國RETSCH公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗設計

實驗1：以櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落數為評價指標，以電場強度、處理時間為因素，設置10 個水平進行試驗，試驗設計見表1。

實驗2：進一步以腐爛率、乙烯釋放量、呼吸速率和質量損失率為評價指標，從表1中選擇CK、處理組1-1（處理組1，電場強度最低、時間最短）以及處理組3-3（處理組2，電場強度最高、時間最長）進行試驗，試驗設計及見表2。

表1 高壓靜電場處理櫻桃番茄試驗因素水平Table 1 Electric field intensities and durations of HVEF treatment

表2 高壓靜電處理實驗組別表Table 2 Experimental groups for high voltage electrostatic field treatment

對實驗2中CK組、處理組1和處理組2的果實，通過超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrum，UPLC-MS/MS）檢測平臺和自建數據庫進行代謝物檢測，并對檢測出的代謝組數據進行代謝物數據處理與分析。每組處理共3 次重復。

1.3.2 大腸桿菌接種

將大腸桿菌O157:H7在37 ℃ LB液體培養基中培養至濃度約為5×106CFU/mL備用。在實驗1中，將果實浸泡在大腸桿菌懸液中5 min，以保證充分接種。每次處理15 個櫻桃番茄，5 個一組，共3 組重復。

1.3.3 HVEF處理

將櫻桃番茄置于高壓靜電場試驗儀器的果實處理裝置中進行HVEF處理，其中實驗1為接菌后的果實，實驗2為未接菌的果實。實驗2將處理后的果實置于90%相對濕度、4 ℃的冷庫貯藏備用。HVEF處理在室溫下進行。本實驗所設計使用的高壓靜電場試驗儀器可手動調節電壓和電極板間的距離。因此，本實驗中不同處理組所需要的電場強度是通過改變電壓和電極板間距離的數值來獲得的，具體計算如公式（1）所示。

1.3.4 菌落形成單位計數法計算大腸桿菌菌落總數

實驗1中，HVEF處理后，采用菌落形成單位計數法計算櫻桃番茄表面的大腸桿菌數量。選取（25±1）g完整櫻桃番茄果實置于225 mL、質量濃度為0.85%的氯化鈉溶液中，櫻桃番茄與氯化鈉溶液的質量體積比為1∶10，置于搖床上充分搖晃得到樣品原液。取100 μL原液，分別用無菌蒸餾水稀釋10、100、1 000倍，共3 個梯度。吸取稀釋后的溶液各100 μL，于無菌EMB培養基涂布均勻，等待培養基上無水滴后于37 ℃恒溫培養48 h，進行平板菌落計數。計算櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落總數[20]。

1.3.5 腐爛率測定

實驗2中，HVEF處理后測定腐爛率。每隔24 h測定腐爛率。每次處理120 個櫻桃番茄，40 個一組，共3 組重復。腐爛率按式（2）計算。

1.3.6 質量損失率的測定

實驗2中，HVEF處理后測定質量損失率。每隔24 h測定質量，計算質量損失率。每次處理120 個櫻桃番茄，40 個一組，共3 組重復。質量損失率按式（3）計算。

1.3.7 乙烯釋放量的測定

實驗2中，HVEF處理后測定乙烯釋放量。將櫻桃番茄置于300 mL樂扣盒中，每隔24 h蓋上蓋子，1 h后用1 mL針管抽取1 mL氣體，進樣口中，加熱器設定溫度140 ℃，流速33 mL/min，隔墊吹掃流速為3 mL/min；色譜柱流速30 mL/min，壓力18.118 psi；柱箱溫度100 ℃；檢測器中，加熱器溫度230 ℃，空氣流速400 mL/min，氫氣燃氣流速40 mL/min，尾吹氣流速（N2）為10 mL/min。每次處理24 個櫻桃番茄，8 個一組，共3 組重復。

1.3.8 呼吸速率的測定

實驗2中，HVEF處理后測定呼吸速率。將櫻桃番茄置于300 mL樂扣盒中，每隔24 h蓋上蓋子，1 h后用便攜式O2/CO2測定儀測定呼吸速率。每次處理24 個櫻桃番茄，8 個一組，共3 組重復。

1.3.9 代謝組學分析樣品提取流程

實驗2中，HVEF處理后進行代謝組學分析。櫻桃番茄樣品放置于凍干機中真空冷凍干燥，隨后利用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀。稱取100 mg的粉末，溶解于0.6 mL體積分數70%甲醇提取液中，并將溶解后的樣品于4 ℃冰箱過夜，期間漩渦6 次以提高提取率；將提取液離心（10 000×g、10 min）后吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.10 代謝物定性與定量分析

基于自建數據庫MWDB（metware database），根據二級譜信息進行物質定性，分析時去除了同位素信號，含K+、Na+、NH4+的重復信號，以及本身是其他更大分子質量物質碎片離子的重復信號。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）利用前幾個主要成分揭示各組之間的總體代謝差異以及組內樣本之間的變異性。將原始數據壓縮成n個主成分來描述原始數據集的特征，PC1表示能描述多維數據矩陣中最明顯的特征，PC2表示除PC1之外所能描述數據矩陣中最顯著的特征，PC3…PCn以此類推。PCA用R軟件（www.r-project.org/）的內置統計prcomp函數，設置prcomp函數參數scale=True，表示對數據進行unit variance scaling（UV）歸一化。

1.4.2 正交偏最小二乘法判別分析

正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）可以最大程度地提高組間的差異，是一種篩選差異代謝物的有效方法。OPLS-DA在原始數據進行log2轉換后，再進行中心化處理，利用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數進行分析。Q2是評估OPLS-DA中模型的重要參數。Q2大于0.5時可認為是有效的模型，Q2大于0.9表示模型出色。

1.4.3 差異代謝物篩選

在對檢測到的代謝物進行定性和定量分析后，結合具體樣品的分組情況，比較各分組中代謝物定量的差異倍數（fold change，FC）變化，并對各分組間的差異倍數進行log2處理后，將變化排在前面的差異表達代謝物進行結果展示。篩選標準：選取FC≥2和FC≤0.5的代謝物。代謝物在對照組和實驗組中FC≥2和FC≤0.5，則認為差異顯著。

1.4.4 差異代謝物KEGG分類和代謝物富集分析

利用KEGG數據庫[21]對差異代謝物進行注釋，對差異顯著代謝物KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類。根據差異代謝物結果，進行KEGG通路富集，其中富集因子為通路中差異表達代謝物的個數與該通路中所有檢測到的代謝物總數之間的比值，該值越大表示富集程度越大。

2 結果與分析

2.1 微生物分析結果

采用菌落形成單位計數法測定未經HVEF處理（CK組）和HVEF處理后的櫻桃番茄表面大腸桿菌菌落總數，結果如圖1所示。與CK組大腸桿菌菌落總數（4.79（lg（CFU/g）））相比，不同處理水平的果實表面大腸桿菌菌落總數均顯著降低（P＜0.05），降低數量在1.44～2.15（（lg（CFU/g）））之間，說明HVEF處理能夠有效殺滅櫻桃番茄果實表面的食源性致病菌，保障消費者健康。

圖1 HVEF處理對櫻桃番茄果實表面大腸桿菌菌落總數的影響Fig. 1 Effect of HVEF treatment on the total number of Escherichia coli colonies on the surface of cherry tomato fruits

2.2 生理指標分析結果

2.2.1 腐爛率

腐爛率是判斷果蔬保鮮效果的重要指標。HVEF處理后果實在18 d貯藏期的腐爛率變化如圖2所示。CK組果實在第8天開始腐爛，腐爛率達到5.83%；處理組1沒有發生腐爛，而處理組2腐爛率僅為0.83%。貯藏8～18 d，各組腐爛率均逐漸增加，但兩個處理組的腐爛率較CK組始終低5%～10%。此外，兩個處理組在貯藏8～12 d期間的腐爛率較為接近，但在貯藏14 d后，處理組2的腐爛率與處理組1相比低5%～9%。上述結果表明，HVEF處理能夠延緩櫻桃番茄采后腐爛，延長貯藏時間，且腐爛率的降低與處理強度和時間有關。

圖2 HVEF處理對櫻桃番茄果實腐爛率的影響Fig. 2 Effect of HVEF treatment on decay rate of cherry tomato fruits

2.2.2 質量損失率

質量損失率可以反映果實水分的散失狀況[22]。HVEF處理后櫻桃番茄的質量損失率變化如圖3所示。隨著貯藏時間的延長，CK組和處理組的質量損失率都呈增加趨勢。各組間質量損失率差異均不顯著，說明HVEF處理對櫻桃番茄采后質量損失并無影響。

2.2.3 乙烯釋放量

內源乙烯的大量合成會加速果實的成熟與衰老[23]。由于4 ℃貯藏環境下，果實的乙烯釋放量偏低，為了更好地研究HVEF處理后果實的乙烯釋放量變化，將HVEF處理后的果實放置于20 ℃下貯藏，并測定其乙烯釋放量，結果如圖4所示。HVEF處理后第0天，處理組的乙烯釋放量均低于CK組；處理后1～2 d，兩個處理組的乙烯釋放量仍低于CK組；隨著貯藏時間的延長，3 組之間乙烯釋放量總體無顯著性差異，但處理組的乙烯釋放量依然低于CK組。以上結果表明，HVEF處理對果實內源乙烯的合成與釋放在貯藏前期有一定的抑制作用，從而有助于延緩櫻桃番茄果實的衰老進程，延長貯藏時間。

2.2.4 呼吸速率

呼吸速率是評價果實采后成熟衰老和貯藏性的重要指標之一[24-25]。由于4 ℃貯藏環境下果實呼吸速率偏低，為了更好地研究HVEF處理后櫻桃番茄的呼吸速率變化，將HVEF處理后的果實置于20 ℃下貯藏，并測定其呼吸速率，結果如圖5所示。在前中期貯藏過程中果實的呼吸速率呈下降趨勢，但在貯藏后期果實呼吸速率上升。番茄屬于呼吸躍變型果實[26]，因此后期呼吸速率上升可能是由于內源乙烯含量上升，誘導番茄果實發生呼吸躍變。但不同的處理組之間總體無顯著差異。上述結果表明，HVEF處理在殺菌保鮮的同時，可以保證櫻桃番茄果實正常的呼吸速率。

圖5 HVEF處理對櫻桃番茄果實呼吸速率的影響Fig. 5 Effect of HVEF treatment on respiration rate of cherry tomato fruits

2.3 代謝組學分析結果

2.3.1 代謝物定性分析結果

利用Analyst 1.6.3軟件處理質譜數據。對每個時間點質譜圖中所有離子的強度進行加和，然后連續描繪得到圖譜，進而分析獲得混樣質控（quality control，QC）樣本的總離子流（total ions current，TIC）重疊圖。通過對不同QC樣本TIC圖進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復性和可靠性。結果如圖6所示，代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，表明質譜對同一樣品檢測不同時間時，信號穩定性較好。同時，以橘皮素和5,6,7,4’-四甲氧基黃酮為例，對具體代謝物二級質譜圖進行展示（圖7）。二級質譜圖顯示出兩種代謝物在質譜分析過程中的碎片離子信息。將檢測出的二級質譜圖與數據庫中二級譜圖進行比對，實現代謝物定性。

圖6 QC樣本質譜檢測TIC重疊圖Fig. 6 Overlapping total ion current (TIC) chromatographs of QC samples

圖7 代謝物二級質譜圖Fig. 7 Secondary mass spectra of metabolites

2.3.2 代謝物PCA和層次聚類分析結果

PCA得分圖如圖8所示。前兩個主成分PC1和PC2的貢獻率分別為24.07%和20.93%，兩者的累計貢獻率達到45%。在PCA得分圖中3 個組和QC樣品可以分開，并且處理組1、處理組2和QC重復的樣本緊湊聚集，表明實驗可重復且可靠。CK組樣本較離散，可能是由于生物差異性導致的。為消除數量對模式識別的影響，對每種代謝物的峰面積進行lg變換，隨后進行層次聚類分析，以展示CK組分別與處理組1和處理組2的代謝物差異。圖9中CK組含量較高的代謝物集中在聚類分析結果的中下部，而處理組1和處理組2含量較高的代謝物分別聚集在中上部和上部。PCA和聚類分析共同表明3 個組的果實具有不同的代謝產物譜。

圖8 PCA得分圖Fig. 8 PCA score plot of PC1 versus PC2

圖9 層次聚類分析Fig. 9 Hierarchical clustering analysis

2.3.3 代謝物OPLS-DA結果

OPLS-DA模型成對比較了不同處理組中樣品的代謝物含量。圖10分別顯示了CK組和處理組1間的差異（R2X＝0.747，R2Y＝1，Q2＝0.988）、CK組和處理組2之間的差異（R2X＝0.727，R2Y＝0.999，Q2＝0.992）以及處理組1和處理組2之間的差異（R2X＝0.722，R2Y＝1，Q2＝0.998）。所有處理組間比較的Q2均超過0.9，說明這些模型穩定且可靠，可用于代謝物篩選。

圖10 OPLS-DA模型Q2Fig. 10 Q2 value of OPLS-DA model

2.3.4 差異代謝物篩選

如圖11所示，處理組1與CK組間共有20 種代謝物存在顯著差異（P＜0.05），其中10 種代謝物上調，10 種代謝物下調；處理組2與CK組之間共有14 種代謝物存在顯著差異（P＜0.05），其中8 種代謝物含量上調，6 種代謝物含量下調。表3顯示，HVEF處理后差異代謝物的變化主要存在上調和下調兩種趨勢。

表3 HVEF處理后櫻桃番茄差異代謝物的主要變化趨勢Table 3 Major trend of differential metabolites in cherry tomato fruits after HVEF treatment

圖11 處理組1與CK組差異代謝物（A）以及處理組2與CK組差異代謝物（B）Fig. 11 Differential metabolites between treatment group 1 and control group (A), and between treatment group 2 and control group (B)

在上調趨勢中，共有3 種上調形式。第1種上調方式是相比CK組，處理組1和處理組2的代謝物含量均顯著上升（P＜0.05），但兩個處理組間無顯著差異（P＞0.05）。該類代謝物主要包括屬于類黃酮的橘皮素、川陳皮素（5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮）、5,6,7,4’-四甲氧基黃酮，以及生物堿中的打碗花精B2。說明在電場強度最低、時間最短和電場強度最高、時間最長的條件下，這些代謝物含量變化程度是一致的。第2種上調方式是處理組1的代謝物含量與CK組無顯著差異（P＞0.05），但當電場強度和處理時間在處理組1的基礎上進一步增加和延長時（處理組2），代謝物含量顯著上升（P＜0.05）。這類代謝物主要包括生物堿中的三(二氫咖啡酰)精胺和番茄堿。說明只有電場強度較大的時候，才會引起這些代謝物的變化。第3種上調方式是代謝物的含量會隨著電場強度增大和處理時間延長而增加，即處理組1的代謝物含量高于CK組，而處理組2的代謝物含量高于處理組1且較CK組顯著提高（P＜0.05），如生物堿中的番茄次堿酚。說明這些代謝物含量的變化與高壓靜電的強度有關。

在下調趨勢中，共有3 種下調形式。第1種下調方式是相比于CK組，處理組1和2中代謝物含量均顯著下降（P＜0.05），但兩個處理組間無差異（P＞0.05），如類黃酮中的6-羥基-5,7,4’-三甲氧基黃酮。第2種下調方式是處理組1與CK組的代謝物含量間無顯著差異（P＞0.05），但處理組2的代謝物含量較CK組顯著下降（P＜0.05），主要有酚酸類的3,4-二甲氧基肉桂酸、阿魏酰蘋果酸以及脂質中的順-10-十七碳烯酸。第3種下調方式是處理組1的含量低于CK組，而當電場強度和處理時間進一步增加時（處理組2），代謝物含量進一步下降，且與CK組比顯著下降（P＜0.05），包括酚酸類的呋喃果糖基-α-D-(3-芥子酰基)葡萄糖苷和屬于氨基酸及其衍生物的L-谷氨酰胺-O-葡萄糖苷。

總體而言，HVEF處理后的差異代謝物主要為類黃酮、有機酸、生物堿、脂質和萜類等。其中類黃酮作為植物中一類重要的多酚類次生代謝物質，不僅能夠影響果實的色澤和風味，還在抗癌、降血脂、抗病毒、抗糖尿病等方面也有重要作用[27-28]；而番茄堿有助于增強機體免疫功能，并具有抗腫瘤的潛在功效[29-30]；此外，有機酸和酚酸類物質與果實甜酸風味密切相關[31]。由于HVEF處理后櫻桃番茄中部分類黃酮和番茄堿物質含量上升且一些酚酸類物質含量下降，說明HVEF處理具有改善櫻桃番茄果實的風味品質和營養價值的作用。

2.3.5 差異代謝物KEGG分類和代謝物富集分析結果

將不同代謝物映射到KEGG數據庫，查看有關途徑的信息。差異顯著代謝物KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類。處理組1與CK組的不同代謝物富集結果表明，所有代謝產物都映射為“代謝”（圖12）。進一步進行KEGG途徑富集分析，以確定處理組1與CK組之間代謝途徑的差異。富集分析結果顯示，“類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）”的代謝物在兩個組之間具有顯著差異（P＜0.05）（圖13）。然后對“類黃酮生物合成”途徑上的代謝物進行分析，如圖14所示。與CK組相比，處理組1的櫻桃苷（prunin）、查耳酮2’-O-葡萄糖苷（chalcone 2’-O-glucoside）、二氫槲皮素（dihydroquercetin）在類黃酮生物合成通路中代謝旺盛。對處理組2與CK組進行代謝物富集，但不同代謝物無法富集到代謝通路，這可能是由于差異代謝物沒有對應的KEGG通路。

圖12 差異代謝物KEGG分類（處理組1與CK組對比分析）Fig. 12 KEGG classification of differential metabolites (comparison between treatment group 1 and control group)

圖13 差異代謝物富集分析Fig. 13 Enrichment analysis of differential metabolites

圖14 類黃酮生物合成代謝通路（處理組1與CK組對比分析）Fig. 14 Metabolic pathways of flavonoid biosynthesis (comparison between treatment group 1 and control group)

3 結 論

本實驗研究了HVEF處理技術對櫻桃番茄采后腐爛率、大腸桿菌菌落總數、相關生理指標以及代謝物含量的影響。結果表明，不同電場強度和處理時間的HVEF處理均能顯著降低果實表面的大腸桿菌菌落總數，但各處理組間無顯著差異。同時，HVEF處理能降低櫻桃番茄果實采后貯藏期間的腐爛率，且增大電場強度和延長處理時間能夠在貯藏后期進一步降低果實腐爛率。生理生化指標分析結果表明，HVEF處理能夠減少果實采后貯藏早期的乙烯釋放量，但隨時間的延長該影響會逐漸減弱；同時，HVEF處理對貯藏過程中果實的質量損失率和呼吸速率影響較小。對HVEF處理后的果實樣品進行代謝組學分析、PCA和聚類分析，結果表明不同HVEF處理的櫻桃番茄存在代謝產物譜差異，篩選結果顯示差異代謝物主要為黃酮類、有機酸、生物堿、脂質和萜類，其中類黃酮、生物堿等物質含量升高，酚酸類含量下降，說明HVEF處理能夠有助于改善櫻桃番茄果實的采后品質；類黃酮生物合成代謝通路的分析表明，處理組1與CK組之間部分代謝物具有顯著差異（P＜0.05）。本實驗結果可為櫻桃番茄采后殺菌保鮮和品質改善提供技術參考。同時，有關HVEF處理對櫻桃番茄果實的殺菌機制和代謝通路的調控機制還有待進一步研究。