酶法水解猴頭菇多肽的生物活性

于弋涵，杜偉寧，胡秋輝，蘇安祥，徐 輝，劉建輝，謝旻皓，楊文建,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京外國語學校，江蘇 南京 210018）

猴頭菇（Hericium erinaceus）與魚翅并稱“山珍猴頭、海味魚翅”，不僅味道鮮美可口，還含有豐富的營養物質，其中蛋白含量豐富，是我國傳統的食藥兩用真菌[1]。在猴頭菇干制品中每100 g約含有27 g蛋白質，同時富含17 種氨基酸，其中包含有人體所必需的8 種氨基酸[2]。有研究利用蛋白組學和基因組學技術研究猴頭菇中參與生物調節活性的蛋白，其中有722 種蛋白存在差異表達，有專家推測這些差異蛋白可能與分子信號傳導、次級代謝和能量代謝等相關，這說明猴頭菇生物合成基因的差異調控，使之產生了不同藥理作用的活性代謝物質[3]。但目前對于猴頭菇中活性物質的研究多在猴頭菇多糖以及猴頭菇醇浸提物和水浸提物方面[1]，對于猴頭菇活性蛋白和活性肽的研究鮮有報道。

生物活性肽相較于蛋白質，具有更容易被人體吸收利用[4]、在較小濃度下具有較強的生物活性的特點[5]。近年來，國內外學者在食用菌活性肽研究方面取得了很大的進展。食源活性肽的制備大多是利用酶法水解，這種制備方法操作簡單、成本低，被廣泛用于工業制備[6-8]。在特定條件下，利用酶切出特定的片段，通過分離純化技術可得到生物活性肽。程湛等[9]通過堿性蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶制備香菇多肽，發現復合蛋白酶酶解得到的香菇多肽具有較好的抗氧化和醒酒活性。李桂峰等[10]通過響應面設計優化木瓜蛋白酶酶解雙胞菇的條件并獲得具有抗氧化活性的雙胞菇肽。張勝等[11]采用體外細胞培養研究靈芝活性肽的生物活性，結果發現靈芝活性肽對肝癌細胞具有抑制生長、促進凋亡的作用。除此之外，還有研究表明利用多種酶酶解茶樹菇、松茸、滑菇、杏鮑菇等蛋白制備的生物活性肽具有多種生物活性[12-15]。由此看出食用菌中生物活性肽資源豐富，有很大的發展和挖掘潛能。

基于此，本研究利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶對猴頭菇蛋白進行酶解，探究體外抗氧化功能，并利用體外培養小鼠單核巨噬細胞RAW264.7、人肝癌HepG-2細胞探究猴頭菇多肽的抗炎和抗腫瘤活性，為猴頭菇中生物活性肽的分離純化制備提供基礎信息，同時為猴頭菇功能成分開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇（干制品） 黑龍江東寧北域良人山珍食品有限公司；堿性蛋白酶（2 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、風味蛋白酶（2 500 U/mg） 葉源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯喹啉-4,4’-二甲酸二鈉（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4） 北京索萊寶科技有限公司；高糖培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、青鏈霉素、胰蛋白酶 美國Gibco生物科技公司；NO測定試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測試劑、白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-10酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠單核巨噬細胞RAW264.7、人肝癌HepG-2細胞 上海瑞鹿生物技術有限公司；其他試劑（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Tube Mill 100 control 磨粉機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；TE2145電子天平 美國賽多利斯科學儀器有限公司；SB25-12超聲清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Academic超純水系統 美國Millipore公司；GL-21M離心機 上海市離心機械研究所有限公司；L-8800氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；FACSCalibur流式細胞儀美國Becton Dickinson公司；8000系列二氧化碳細胞培養箱 美國Thermo Fisher公司；SpectraMax M2e多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇多肽的制備

猴頭菇多肽的制備參考文獻[16]。將猴頭菇干制品利用磨粉機制備成猴頭菇粉，過80目篩后按料液比1∶20加入蒸餾水，以0.1 mol/L NaOH溶液調至浸提液pH值為13，70 ℃水浴加熱8 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液。沉淀重復上述操作進行復提，合并2 次上清液，用0.1 mol/L HCl溶液調整上清液pH值為3，靜置30 min，在12 000 r/min的條件下離心20 min，得到蛋白質沉淀。用少量超純水攪勻蛋白，加入0.1 mol/L NaOH溶液調節至中性，后利用截留分子質量 500 Da、直徑25 mm的透析袋透析10 h，透析外液為去離子水，每2 h更換一次透析外液。60 ℃旋蒸，體積濃縮至原體積三分之一后冷凍干燥，得到猴頭菇粗蛋白備用。采用凱氏定氮法測定猴頭菇粗蛋白中蛋白質量分數為71.43%。將猴頭菇粗蛋白溶于水中（10 g/L）按照表1用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液調節pH值并分別在木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶的作用下進行酶解，加酶量為0.1 g/L，酶解4 h后90 ℃加熱10 min終止反應，12 000 r/min離心后取上清液進行冷凍干燥，得到猴頭菇粗多肽分別命名為HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，置于室溫干燥器中儲存備用。

表1 蛋白酶最適水解條件Table 1 Optimum conditions for protease hydrolysis used in this study

1.3.2 猴頭菇多肽氨基酸組成的分析

采用氨基酸自動分析儀測定猴頭菇多肽氨基酸組成。稱取1 mg的猴頭菇多肽于安瓿管中，加入6 mol/L的濃鹽酸，用保鮮膜封閉管口，在110 ℃下水解24 h后，將水解液全部轉移至旋轉蒸發儀內蒸干，用0.02 mol/L HCl溶液溶解并調節氨基酸濃度在40 nmol/L。采用氨酸酸自動分析儀進行氨基酸組分分析。

1.3.3 猴頭菇多肽表面疏水性的測定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonate，ANS）熒光探針法測定猴頭菇多肽的表面疏水性[17]。將HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T溶于PBS（0.01 mol/L、pH 7.4，后同）配制成質量濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的溶液。取4 mL樣品溶液，加入20 μL 8 mmol/L ANS。熒光分光光度計測定樣品的熒光強度（其中激發波長390 nm、發射波長470 nm），以樣品質量濃度為橫坐標，以熒光強度為縱坐標作圖，擬合曲線初始階段的斜率即為猴頭菇多肽的表面疏水性指數。

1.3.4 猴頭菇多肽抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的測定

在96孔板中分別加入50 μL質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴頭菇多肽或VC溶液，然后加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均勻，其中空白為超純水，對照為50 μL超純水中加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液。室溫下，在黑暗中靜置30 min后，通過酶標儀測定517 nm波長處的吸光度，按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為對照的吸光度；A1為添加不同質量濃度猴頭菇多肽或VC溶液的吸光度；A2為空白的吸光度。

1.3.4.2 ?OH清除率的測定

準確吸取0.15 mL濃度5.0 mmol/L的鄰二氮菲溶液加入試管中，再加入0.4 mL濃度0.75 mol/L PBS（pH 7.4）和0.25 mL蒸餾水，充分混勻。然后加入0.6 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液后立即混勻。實驗組試管中分別加入0.1 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴頭菇多肽或VC溶液，并加入0.1 mL體積分數1% H2O2溶液；空白組試管中加入0.1 mL的蒸餾水和0.1mL體積分數為1% H2O2溶液；對照組試管中加入0.2 mL的蒸餾水。各組溶液于37 ℃條件下保溫60 min后冷卻至室溫，測定536 nm波長處吸光度。按照式（2）計算?OH清除率。

式中：A1為對照組吸光度；A2為實驗組吸光度；A3為空白組吸光度。

1.3.5 猴頭菇多肽對RAW264.7細胞抗炎活性的測定

1.3.5.1 RAW264.7細胞的培養

RAW264.7細胞用完全培養基（含體積分數10% FBS和體積分數0.5%青鏈霉素的DMEM培養基）在5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，待細胞生長至對數生長期進行傳代。當細胞鋪板率大于培養瓶底面積的80%時，吸盡原培養基并用移液槍吸取3 mL PBS，洗滌細胞兩次，除去漂浮的死細胞，隨后用移液槍吸取2 mL完全培養基吹打細胞至完全脫落，調整細胞懸液濃度為1×104個/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于細胞培養箱中孵育24 h。

1.3.5.2 RAW264.7細胞增殖率的測定

使用MTT法評估猴頭菇多肽對RAW264.7細胞的毒性[18]。1.3.5.1節96 孔板中RAW264.7細胞37 ℃孵育24 h后吸盡培養液，用PBS洗滌數次。空白組加入200 μL的DMEM，對照組（不含RAW264.7細胞）加入200 μL/孔DMEM，實驗組加入200 μL/孔含400 μg/mL猴頭菇多肽的DMEM，每組設置5 個平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培養基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。將96 孔板置于恒溫振蕩器上室溫振蕩20 min后，測定570 nm波長處的吸光度，按照式（3）計算細胞增殖率。

式中：A1為實驗組吸光度；A0表示對照組吸光度；A2表示空白組吸光度。

1.3.5.3 NO濃度的測定

采用Griess法對RAW264.7細胞的NO釋放量水平進行測定[19]。將1.3.5.1節96 孔板中RAW264.7細胞，孵育24 h，去除上層培養液。96 孔板中加入100 μL 10 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），放置在培養箱中孵育4 h后加入100 μL不同質量濃度（0、50、100、200、400 μg/mL）的樣品，培養24 h，收集上清液并參考NO測定試劑盒說明書測定NO濃度。

1.3.5.4 IL-6、IL-10質量濃度的測定

參考ELISA試劑盒說明書測定RAW264.7細胞IL-6、IL-10質量濃度。

參照1.3.5.3節方法建立炎癥模型，即用10 μg/mL LPS處理RAW264.7細胞4 h后移除上清液。實驗組加入不同質量濃度的猴頭菇多肽（50、100、200、400 μg/mL），空白組加入完全培養基，孵育24 h。每組樣品設置5 個平行。

1.3.6 猴頭菇多肽抑制HepG-2細胞活性的測定

1.3.6.1 HepG-2細胞的培養

HepG-2細胞用完全培養基置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，待細胞生長至對數生長期進行傳代。當細胞鋪板率大于培養瓶底面積的80%時，吸盡原培養基并用移液槍吸取3 mL PBS，洗滌細胞兩次，除去漂浮的死細胞，隨后用移液槍吸取2 mL胰蛋白酶溶液（質量分數0.25%，后同），覆蓋細胞約30 s后吸去胰蛋白酶溶液，培養箱放置2 min后加入2 mL完全培養基吹打細胞至完全脫落，調整細胞懸液濃度為1×104個/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于細胞培養箱中孵育24 h。

1.3.6.2 HepG-2細胞增殖率的測定

將1.3.6.1節96 孔板中HepG-2細胞37 ℃孵育24 h后吸除培養液，用PBS洗滌數次。參照1.3.5.2節方法測定HepG-2細胞在200 μg/mL猴頭菇多肽、50 μg/mL5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）（陽性對照組）作用下的HepG-2細胞增殖率。

1.3.6.3 乳酸脫氫酶釋放率的測定

將1.3.6.1節96 孔板中HepG-2細胞，孵育24 h后去除上層培養液。分別用不同質量濃度的樣品（50、100、200、400 μg/mL）處理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作為陽性對照組，等體積的DMEM為空白組，不含細胞的等體積DMEM為對照組。培養結束后，小心吸取孔內上清液，利用LDH檢測試劑盒檢測上清液中LDH水平。按照式（4）計算LDH釋放率。

式中：A1為空白組吸光度；A0為對照組吸光度；A2為添加樣品的實驗組吸光度。

1.3.6.4 MDA含量的測定

通過硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[20]測定HepG-2細胞內MDA含量。將1.3.6.1節96 孔板中HepG-2細胞，孵育24 h后去除上層培養液。分別用不同質量濃度的樣品（50、100、200、400 μg/mL）處理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作為陽性對照組，等體積的培養基為空白組。培養結束后，吸棄上清液。加入100 μL細胞裂解液裂解細胞，裂解完成后，10 000×g離心10 min，取上清液后參考MDA試劑盒說明書測定各組HepG-2細胞中MDA含量，單位為U/mg。

1.3.6.5 流式細胞儀測定細胞凋亡

使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒對HepG-2細胞凋亡狀況進行測定。按照1.3.6.1的方法培養HepG-2細胞，細胞培養結束后，收集細胞培養液，用PBS洗滌細胞，然后加入0.5 mL胰蛋白酶溶液。室溫孵育2 min，吸除胰蛋白酶溶液，加入收集的細胞培養液，吹打細胞，移至離心管，1 000×g離心5 min，棄去上清液，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數，取5×104個重懸的細胞，1 000×g離心5 min，棄去上清液，依次加入195 μL的Annexin V-FITC結合液，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，混勻。室溫避光孵育15 min后，待測液保存于冰盒中。使用流式細胞儀測定細胞凋亡量，檢測前需輕輕重懸細胞，用FlowJo軟件分析流式細胞儀檢測結果。

1.4 數據處理與分析

數據以3 次測定結果的平均值±標準差表示，所得數據使用SPSS 20.0軟件進行處理和分析，采用Duncan檢驗進行顯著性統計分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同的猴頭菇多肽氨基酸組成

活性肽的功能取決于其特殊的氨基酸以及排列順序，有研究表明，谷氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等有利于提高活性肽的抗氧化活性，具有較強的自由基清除活性，除此之外，疏水性氨基酸可以增強肽與脂類的相互作用更易于進入靶細胞發揮抗炎與抗癌細胞活性[21]。因此，不同的氨基酸組成對活性肽發揮生物活性至關重要。本實驗對4 種猴頭菇多肽進行氨基酸分析結果如表2所示，4 組酶解物的氨基酸組成都富含谷氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和蛋氨酸，這些氨基酸都有助于增強其抗氧化作用。HEPH-A和HEPH-T的必需氨基酸含量最高，為132.11 mg/g和141.38 mg/g，表明猴頭菇多肽具有較好的營養價值，此外疏水性氨基酸含量也均高于另外兩組，表明它們更容易進入細胞發揮作用。

表2 猴頭菇多肽的氨基酸組成及含量Table 2 Amino acid composition of HEPHs

續表2

2.2 不同猴頭菇多肽的表面疏水性指數

在天然蛋白質分子中，疏水基團埋藏在其折疊結構內，蛋白質被水解后就會暴露這些基團，表現在其表面疏水性的增加，而隨著水解程度的加劇，暴露的基團又會被水解成更小的肽段，甚至是氨基酸，從而失去其表面疏水性[22]。研究認為活性肽的疏水性結構會顯著影響抗氧化活性，活性肽N-端的疏水殘基也有助于提高抗氧化的作用[23]。由圖1可知，HEPH-A具有較高的表面疏水性指數（1 256.67±5.37），其次為HEPH-P（1 113.90±3.48）。表明HEPH-A和HEPH-P可能含有與抗氧化活性相關的活性肽。

圖1 不同猴頭菇多肽的表面疏水性指數Fig. 1 Hydrophobicity indices of HEPHs

2.3 不同猴頭菇多肽的抗氧化活性

DPPH自由基作為相對穩定的自由基被廣泛用來檢測以自由基捕獲劑或氫供體形式存在的物質，從而用以評定其抗氧化能力[24]。大量的生化反應會生成超氧陰離子，雖然它們不能直接引起脂肪氧化，但是能與?OH發生反應，對機體的危害極大[25]。因此本實驗考察了猴頭菇多肽對DPPH自由基和?OH的捕捉能力。如圖2A所示，隨著樣品質量濃度升高，DPPH自由基清除率不斷升高，1.0 mg/mL HEPH-P的DPPH自由基清除率達到（53.01±0.27）%，盡管低于VC的DPPH自由基清除率（（96.63±0.27）%），但仍顯示出較高的DPPH自由基清除活性，說明HEPH-P中含有與DPPH自由基清除相關的活性肽組分。如圖2B所示，不同猴頭菇多肽的?OH清除率隨濃度上升而升高，其中1.0 mg/mL HEPH-P的?OH清除率（（55.73±1.52）%）大于其他猴頭菇多肽，表現出較好的?OH清除效果。這與圖2A的DPPH自由基清除率結果是一致的，表明HEPH-P中含有與抗氧化相關的活性肽組分。此結果與梁杰等[26]研究中木瓜蛋白酶可以水解出具有抗氧化活性多肽的結果是一致的。

圖2 猴頭菇多肽的DPPH自由基清除活性（A）和·OH清除活性（B）Fig. 2 DPPH (A) and hydroxyl radical (B)-scavenging activity of HEPHs

2.4 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細胞抗炎活性的影響

2.4.1 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細胞增殖率的影響

細胞增殖率可用來測定細胞生長分裂情況，常用來表征樣品對細胞活性的影響[27]。選取高劑量400 μg/mL對小鼠巨噬細胞RAW264.7進行細胞毒性測定，結果如圖3所示。經HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T處理后，RAW264.7細胞的細胞增殖率分別為（108.20±1.20）%、（103.94±1.23）%、（115.35±2.06）%、（90.28±1.24）%，均高于80%，表明猴頭菇蛋白水解物作用質量濃度不高于400 μg/mL時，對小鼠巨噬細胞的毒性作用低，可用于進行細胞實驗。

圖3 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細胞增殖率的影響Fig. 3 Effect of HEPHs on RAW264.7 cell viability

2.4.2 不同猴頭菇多肽對RAW264.7細胞NO分泌的影響

有研究報道NO參與免疫應答相關的生理過程，是巨噬細胞殺傷病原微生物的主要效應分子之一[28]。過量持續刺激產生的NO和促炎因子會引起細胞的炎癥反應，導致細胞的損傷和凋亡[29]。RAW264.7細胞經LPS刺激后過量表達NO，而細胞內過多的NO不利于緩解炎癥反應。因此對經過不同猴頭菇多肽處理后RAW264.7細胞上清液中NO進行測定，結果如圖4所示。HEPH-A處理組和HEPH-T處理組細胞中的NO釋放量減少，并且隨著樣品濃度的升高，與空白組相比，處理組NO濃度極顯著降低（P＜0.01）。其中，在400 μg/mL HEPH-A處理后的細胞NO濃度為（29.23±1.46）μmol/L，極顯著低于空白組（（53.12±1.26）μmol/L）（P＜0.01），且明顯低于其他猴頭菇多肽處理組，表現出較好的抑制NO產生的效果。由此表明，HEPH-A處理可以有效降低NO分泌，表現出較強的抗炎活性，因此選擇HEPH-A進行后續實驗。

圖4 不同猴頭菇多肽對RAW264.7NO釋放量的影響Fig. 4 Effect of HEPHs on RAW264.7 NO release y

2.4.3 HEPH-A對RAW264.7細胞IL-6、IL-10分泌的影響

巨噬細胞激活后可通過分泌細胞因子傳導并調控免疫通路，其中IL-6、IL-10在其中發揮著重要的作用。有研究表明IL-6能促進原始骨髓源細胞的生長和分化、增強自然殺傷細胞的裂解功能，但是IL-6持續分泌會對細胞產生損傷，加速炎癥反應的發展；而IL-10可以抑制炎性細胞的激活、遷移和黏附，緩解炎癥反應，并在組織修復、過敏反應過程中發揮作用[30]。根據2.4.2節結果，選擇猴頭菇多肽HEPH-A，進一步探究其在LPS刺激炎癥模型中IL-6、IL-10的分泌水平。為了研究HEPH-A對細胞炎癥抑制作用是否通過調控細胞因子的分泌而實現，采用不同質量濃度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）處理RAW264.7細胞后測定細胞IL-6和IL-10的水平，空白組采用等體積的PBS處理，結果發現IL-6質量濃度分別達到（153.04±1.93）、（153.11±1.95）、（139.25±1.66）、（129.85±1.32）ng/mL，空白組為（156.19±1.29）ng/mL（圖5）。與空白組相比，200、400 μg/mL HEPH-A處理RAW264.7細胞的IL-6的分泌量極顯著降低（P＜0.01），說明在一定劑量下HEPH-A可顯著抑制炎癥因子IL-6的分泌。不同質量濃度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）處理后IL-10質量濃度分別為（183.92±1.32）、（200.75±1.62）、（251.40±1.39）、（302.36±1.14）ng/mL，空白組為（359.62±1.31）ng/mL，說明高劑量HEPH-A能有效促進IL-10釋放，并且400 μg/mL HEPH-A處理RAW264.7細胞的IL-10的分泌水平最高。綜上，HEPH-A可以通過抑制IL-6的分泌、促進抑炎因子IL-10的釋放而緩解炎癥反應。

圖5 猴頭菇多肽HEPH-A對RAW264.7細胞中IL-6（A）、IL-10（B）水平的影響Fig. 5 Effect of HEPH-A on the secretion of IL-6 (A) and IL-10 (B) in RAW264.7 cells

2.5 不同猴頭菇多肽對HepG-2細胞的影響

2.5.1 不同猴頭菇多肽對HepG-2細胞活力影響

MTT法是一種檢測細胞存活及生長情況的方法，能直接反映細胞狀態。為了驗證猴頭菇蛋白4 種水解后猴頭菇多肽（HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A及HEPH-T）的體外抗腫瘤活性，利用MTT法研究猴頭菇多肽在（200 μg/mL）對HepG-2細胞增殖抑制作用。結果如圖6所示，空白組細胞增殖率為100%，陽性對照組（50 μg/mL 5-Fu）細胞增殖率為（60.02±1.25）%。與空白組相比，HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A組細胞增殖率極顯著下降（P＜0.01），其中HEPH-P組最低，為（72.14±1.40）%，高于陽性對照組。由此可見，HEPH-P、HEPH-F和HEPH-A能夠極顯著抑制HepG-2細胞增殖（P＜0.01），其中HEPH-P的抑制效果最好，因此選擇HEPH-P進行后續實驗。

圖6 猴頭菇多肽不同組分對HepG-2細胞活力的影響Fig. 6 Effect of HEPH on cell viability of HepG-2 cells

2.5.2 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞LDH釋放的影響

已有研究證明HepG-2肝癌細胞增殖被抑制的原因可能是活性物質促使肝癌細胞細胞膜發生破裂導致細胞死亡。而LDH是一種隨著細胞膜破裂會釋放到膜外的酶，其活力能夠反映細胞膜完整性破壞程度[31]。如圖7所示，將HEPH-P以不同質量濃度（50、100、200、400 μg/mL）作用HepG-2細胞后，細胞中LDH釋放率分別為（108.06±2.35）%、（120.83±2.60）%、（137.36±2.44）%、（149.97±3.25）%，陽性對照組LDH釋放率為（204.34±1.61）%，均極顯著高于空白組（P＜0.01）。HEPH-P作用于HepG-2細胞后使細胞膜發生破裂，LDH被釋放，導致細胞死亡。LDH的釋放率隨添加HEPH-P質量濃度增加而上升，這與李娜等[32]的研究結果是一致的。

圖7 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞中LDH釋放率的影響Fig. 7 Effect of HEPH-P on LDH release in HepG-2 cells

2.5.3 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞MDA含量的影響

MDA是脂質氧化的終產物之一，其含量主要反映HepG-2細胞過氧化的程度，也間接反應細胞的損傷程度[33]。如圖8所示，200 μg/mL HEPH-P處理HepG-2細胞中MDA的含量為（25.98±4.56）U/mg，極顯著高于空白組（P＜0.01）。這與2.5.2節的結果并不矛盾，表明HEPH-P導致細胞膜破裂，細胞內容物外泄導致大量氧化反應，導致MDA含量升高。

圖8 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞中MDA含量的影響Fig. 8 Effect of HEPH-P on MDA content in HepG-2 cells

2.5.4 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞凋亡的影響

為了探究由HEPH-P是否會引起HepG-2細胞的凋亡，使用流式細胞儀分析了凋亡細胞的百分比[34-35]。如圖9所示，HEPH-P可顯著促進凋亡期HepG-2細胞的積累，與空白組（0.28%）相比，400 μg/mL HEPH-P組凋亡細胞比例增加到81.4%，其中早期凋亡細胞比例和晚期凋亡細胞比例分別為80.5%和0.9%。由此可知，HEPH-P處理可以顯著誘導HepG-2細胞凋亡，且主要是早期凋亡。促使細胞凋亡是活性肽發揮抗腫瘤生物活性的重要途徑之一，上述結果表明HEPH-P誘導了HepG-2細胞凋亡。

圖9 猴頭菇多肽HEPH-P對HepG-2細胞凋亡的影響Fig. 9 Effect of HEPH-P on HepG-2 cell apoptosis

3 結 論

本研究通過對猴頭菇蛋白進行酶解制備猴頭菇多肽HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，其中HEPH-P的DPPH自由基清除率和?OH清除率均高于其他猴頭菇多肽，具有較好的抗氧化活性，同時在HepG-2細胞中能夠抑制癌細胞增殖，具體表現在促使細胞膜破裂、LDH釋放以及細胞凋亡，從而抑制癌細胞增殖。除此之外，HEPH-A在體外RAW264.7抗炎模型中表現出抗炎活性，經400 μg/mL HEPH-A處理后，小鼠巨噬細胞RAW264.7 NO分泌量由空白組（53.12±1.26）μmol/L降低為（29.23±1.46）μmol/L，IL-6的釋放減少，IL-10的分泌增加。綜上，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解猴頭菇蛋白得到的猴頭菇多肽具有較好的抗氧化、抗癌和抗炎活性，本實驗揭示了猴頭菇生物活性肽的生物活性，為猴頭菇生物活性肽的制備和應用提供了理論參考。