基于氨基功能化離子液體萃取番茄中超氧化物歧化酶

王 濤，翟 晨，王 亮,*，李夢瑤,，王書雅，謝云峰

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830017；2.中糧營養健康研究院，營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

我國是農業大國，每年的果蔬產量都遠超其他國家，而番茄正是我國眾多果蔬品種中產量較高的一種，其富含大量的番茄紅素、VC以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），營養價值極高[1-2]，但同時也容易發生劣變。SOD是一種廣泛存在于動植物以及微生物體內的金屬抗氧化酶，它與過氧化氫酶、多酚氧化酶等的活性是評判果蔬副產品品質劣變程度的重要指標，SOD可以清除細胞代謝有害物質，抑制果蔬腐敗變質[3-5]。

功能化離子液體是根據離子液體的可設計性，在離子液體的陰、陽離子中引入氨基、羧基和羥基等單個或多個官能團，從而使離子液體具有某些特異性功能或性質，是離子液體應用的一個重要分支[6-8]。功能化離子液體是近幾年發展的一種新型綠色化學功能溶劑，因具有蒸汽壓低、不易揮發、化學穩定性好、熱穩定性好、溶解性優異，易與無機鹽類形成雙水相以及可循環使用，且不會造成環境污染和不會危及操作者健康等多種優勢，引起了學術界的廣泛關注[9-15]。功能化離子液體在具有普通離子液體特性的同時，又由于其結構的變化，在黏度、熔點、配位能力、親水性等方面有極大的優越性。功能化離子液體可以直接從水相中萃取重金屬離子、有機物，且其相對于易揮發有機溶劑而言，萃取率大幅提高[16]。目前，功能化離子液體已經在電化學、有機合成、分離萃取等領域有廣泛的應用[17-20]，而氨基功能化離子液體正是當前研究比較多的一種功能化離子液體。雙水相體系因萃取條件高效溫和而被廣泛應用于生物大分子物質的萃取分離。功能化離子液體-雙水相體系是由親水性功能化離子液體和無機鹽組成的兩相[11]。基于功能化離子液體-雙水相體系，Chen Jing等[21]合成了羥基功能化離子液體，該體系對牛血清白蛋白的萃取得率高達99.6%。施婭楠等[11]采用[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相抽提技術從辣木葉蛋白中分離凝乳酶，其酶活性回收率達到85.5%。

目前，番茄等植物性農產品抗氧化酶的萃取多依賴于傳統的緩沖溶液法[1-3]，利用緩沖溶液法提取的酶活性一般較低，而且提取一般需要40 min，耗時較長；近些年也有利用普通離子液體法對抗氧化酶進行萃取的研究，但大多數關于離子液體的研究都集中于二氧化碳、二氧化硫等氣體的分離以及催化反應，針對萃取蛋白質類物質的研究很少。離子液體萃取SOD是由于其具有較強的溶劑作用，且與蛋白質之間有多種分子作用力，尤其是氫鍵作用力、極性作用力、離子電荷作用力，均會極大提高SOD在離子液體中的溶解度。功能化氨基官能團比普通離子液體更容易與SOD形成氫鍵，而氫鍵作用力是離子液體與蛋白質的多種作用力之一[16]。而氨基功能化離子液體在生物大分子方面的萃取研究還相對較少。

因此本研究擬選用1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[C4Mim]Cl）、1-丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[C3Mim]Cl）、1-胺丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[(H2NC3)Mim]Cl）和1-胺乙基-3-甲基咪唑溴鹽（[(H2NC2)Mim]Br）4 種離子液體與無機鹽形成的雙水相體系，對番茄中的SOD進行萃取研究。以SOD活力為指標，考察離子液體的種類及質量濃度、無機鹽質量濃度、萃取時間和萃取溫度等參數對SOD活力的影響，根據單因素試驗結果進行響應面試驗設計，對實驗條件進行再次優化，以期為果蔬中蛋白酶類物質的高活性萃取提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SOD（1 500 U/mg） 上海士鋒生物科技有限公司；磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、30% H2O2、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（均為分析純） 北京化工廠；[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC3)Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br 上海默尼化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Reference超純水系統 美國Millipore公司；11-102-49SH渦旋混勻器 德國IKA公司；U-3900紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；THZ-103B恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；PB-10型pH計德國Sartorius公司；Thermo ST16R離心機 德國Eppendorf公司；Multi-mode Synergy Mx酶標儀 美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 相圖的繪制

采用濁度滴定法[22-23]進行相圖的繪制。首先分別稱取1 g的離子液體（[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br和[(H2NC3)Mim]Cl）置于10 mL的離心管中，加入一定量的蒸餾水使離子液體完全溶解之后，向含有離子液體溶液的離心管中加入一定量的K2HPO4直至溶液變渾濁，再加蒸餾水至雙水相消失，同時記錄下所添加的無機鹽和蒸餾水的用量，并進行多次如此反復操作以繪制相圖，其中橫坐標為K2HPO4的質量摩爾濃度，縱坐標為離子液體的質量摩爾濃度。

1.3.2 氨基功能化離子液體雙水相萃取SOD

稱取一定質量的氨基功能化修飾的離子液體（終質量濃度為0.4 g/mL）和K2HPO4（終質量濃度為0.6 g/mL）加入到帶有刻度的離心管中，并加入1.5 mL蒸餾水溶解，待其溶解完全后可觀察到體系分為上相（富集離子液體）、下相（富集K2HPO4）的雙水相體系，再向雙水相體系中加入0.5 g研磨成漿的番茄泥振蕩混合均勻。將離心管放置于35 ℃、300 r/min恒溫培養搖床中，振蕩萃取25 min后取出離心管，靜置使兩相完全分開，取上清液（粗酶液）進行SOD活力測定。

1.3.3 緩沖液法萃取SOD

根據文獻[18]方法，配制0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.8）用于萃取番茄中的SOD。具體操作步驟：取新鮮的番茄，放入勻漿機中進行勻漿，再將其倒入研缽中在冰浴狀態下研磨至泥狀，稱取0.5 g研磨成漿的番茄泥加入到含有4.5 mL PBS的離心管中混合均勻，將其放入高速離心機中，在4 ℃條件下以5 000 r/min的轉速離心40 min，離心結束后取上清液于4 ℃環境中待用。

1.3.4 氨基功能化離子液體雙水相萃取SOD工藝優化

準確稱取0.5 g研磨成漿的番茄泥，采用氨基功能化離子液體雙水相萃取法提取粗酶液，考察不同離子液體、氨基功能化離子液體質量濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/mL）、K2HPO4質量濃度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/mL）、萃取溫度（20、25、30、35、40 ℃）以及萃取時間（5、10、15、20、25、30 min）對SOD活力的影響，并在單因素試驗的基礎上設計四因素三水平響應面試驗。

1.3.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選取氨基功能化離子液體質量濃度（A）、K2HPO4質量濃度（B）、萃取溫度（C）以及萃取時間（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平響應面試驗，以SOD活力為響應值，建立響應回歸模型，優化試驗設計，選擇獲得SOD活力最大的萃取工藝，因素水平如表1所示[24-26]。

表1 響應面試驗設計Table 1 Level and code of independent variables used for response surface design

1.3.6 SOD活力測定

SOD活力測定采用鄰苯三酚法[27]。在25 ℃恒溫條件下，以每克番茄樣品每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%所需的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。SOD活力單位為U/g，結果以番茄濕質量計。

1.4 數據統計與分析

實驗過程中均進行3 次獨立重復實驗，結果取平均值，響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 雙水相體系的相圖

大多數無機鹽（K3PO4、K2HPO4和Na2CO3）都能與離子液體形成雙水相，且具有較好的成相能力，其中K2HPO4與離子液體形成的雙水相體系條件相對溫和，因此本實驗擬選用K2HPO4作為成相鹽[22]。從[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC2)Mim]Br和[(H2NC3)Mim]Cl與K2HPO4體系的相圖（圖1）可知，各離子液體的成相能力大小依次為[(H2NC2)Mim]Br＞[C4Mim]Cl＞[C3Mim]Cl＞[(H2NC3)Mim]Cl；而離子液體的成相能力與其親水能力相反，故其親水性由高到低依次為[(H2NC3)Mim]Cl＞[C3Mim]Cl＞[C4Mim]Cl＞[(H2NC2)Mim]Br。

圖1 雙水相體系的相圖Fig. 1 Phase diagrams of aqueous two-phase systems

2.2 SOD萃取參數優化結果

由于不同類型的離子液體對SOD萃取效果有很大的影響。因此，實驗考察了[C4Mim]Cl、[C3Mim]Cl、[(H2NC3)Mim]Cl和[(H2NC2)Mim]Br 4 種不同類型的離子液體對SOD活力的影響。如圖2A所示，氨基功能化離子液體比普通離子液體更容易與SOD形成氫鍵，而氫鍵作用力是離子液體與蛋白質的多種作用力之一[16]，和其他離子液體相比，[(H2NC2)Mim]Br形成的雙水相體系對SOD具有最好的萃取效果，因此選擇[(H2NC2)Mim]Br制備雙水相體系對酶進行提取。

[(H2NC2)Mim]Br質量濃度對SOD萃取效果的影響如圖2B所示，離子液體質量濃度為0.3 g/mL時，對SOD的萃取效果較差，當質量濃度達到0.4 g/mL時，萃取效果最好，之后隨著離子液體質量濃度升高，SOD部分二級結構被改變，并且離子液體膠束的形成也會使部分酶失活，導致活力降低[28]，因此最佳離子液體質量濃度應控制在0.4 g/mL。

無機鹽質量濃度對SOD萃取效果的影響如圖2C所示，當K2HPO4的質量濃度為0.6 g/mL時，SOD能夠保持最高的活力。隨著K2HPO4質量濃度繼續增大，可能會使已經萃取到離子液體相中的酶再轉移到水相中，同時過多的鹽也可能導致酶活力的下降，因此，K2HPO4的最優質量濃度為0.6 g/mL。

萃取溫度、萃取時間對SOD萃取效果的影響分別如圖2D、E所示，隨溫度升高，SOD活力先快速升高再略下降，其中35 ℃下萃取得到的SOD活力最高，因此最優萃取溫度為35℃；隨萃取時間延長，SOD活力逐漸增加，當萃取時間達到25 min后，SOD活力逐漸穩定，因此，萃取時間選擇為25 min。

圖2 不同因素對所萃取的SOD活力的影響Fig. 2 Effects of different extraction parameters on SOD activity

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 試驗設計方案及結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行分析，得到二次回歸擬合方程Y＝344.94+2.51A+3.21B+1.89C+0.58D+0.47AB-1.57AC+2.68AD+1.83BC-0.25BD-0.39CD-26.18A2-26.08B2-22.08C2-22.16D2。

表2 不同因素對SOD活力影響的響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design with experimental values of SOD activity for response surface analysis

對回歸方程進行顯著性檢驗，結果如表3所示，模型P＜0.000 1，說明數據模型方程達到極顯著水平；失擬項是模型中數據的變異，失擬項P＝0.476 7＞0.05，說明數據變異不顯著；即回歸方程與實際結果擬合良好，能充分反映實際情況，誤差小，模型合適。回歸方程各項方差分析表明，回歸模型一次項A、B、C為模型顯著因素，二次項A2、B2、C2、D2為模型極顯著因素，其余各項對SOD活力影響均不顯著。因此，可用此模型SOD的提取工藝和條件進行分析及預測。回歸方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對SOD活力影響由大到小依次為B＞A＞C＞D，即K2HPO4質量濃度對SOD影響最顯著，[(H2NC2)Mim]Br質量濃度與萃取溫度影響次之，萃取時間影響最小。

表3 不同因素對SOD活力影響的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the effects of different extraction parameters on SOD activity

2.3.2 響應面試驗結果分析

響應曲面圖可以反映各因素之間相互作用的強弱，采用Box-Behnken軟件對響應曲面圖進行分析，可以得到各因素交互作用對響應值的影響，結果見圖3。

三維響應面曲線圖可以更直觀地觀察到兩個變量對因變量的影響，等高線圖即為響應面圖的投影，可從等高線圖中得到最佳范圍。由圖3可知，[(H2NC2)Mim]Br質量濃度和K2HPO4質量濃度交互作用的響應曲面最陡峭，說明對SOD活力影響最顯著；[(H2NC2)Mim]Br質量濃度與萃取時間、萃取溫度之間以及K2HPO4質量濃度與萃取時間、萃取溫度的交互作用的響應曲面相對陡峭，說明對SOD活力影響顯著程度次之；萃取時間與萃取溫度的交互作用對提取率的影響顯著程度較小，表現為曲面較平滑，說明對SOD活力無顯著性影響。通過模型優化，得到SOD的最佳提取條件為[(H2NC2)Mim]Br質量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質量濃度0.61 g/mL、萃取溫度35.22 ℃、萃取時間25.08 min；并得到該條件下的SOD活力預測值為345.15 U/g。

圖3 各因素交互作用對SOD活力影響的響應面圖及等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots for the interactive effects of various factors on SOD activity

2.3.3 驗證實驗結果

考慮到實際操作因素，將各因素最佳條件設定為氨基功能化離子液體質量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質量濃度0.60 g/mL、萃取溫度35℃、萃取時間25 min，進行3 次平行實驗，得到萃取的SOD活力平均值為345.68 U/g，與2.3.2節的預測值345.15 U/g接近，驗證了此模型的有效性，說明預測模型與實際情況擬合較好。

2.4 不同方法萃取SOD效果比較結果

在該優化的條件下，實驗以0.4 g/mL [(H2NC2)Mim]Br和0.6 g/mL K2HPO4制備雙水相體系，于35 ℃條件下對番茄中的SOD萃取25 min，對萃取后的SOD活力進行測定，結果如表4所示。[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相萃取得到的SOD活力高于傳統的緩沖液萃取法及[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法，且標準偏差較小，導致這一現象發生的原因主要是氨基功能化離子液體-雙水相是基于目標物與萃取劑之間的相互作用力（如范德華力、氫鍵作用、鹽析效應和疏水作用）導致分配系數的改變，從而達到萃取分離的目的[29-30]。總體來說，氨基功能化離子液體雙水相萃取法優于傳統的萃取方法，該方法受到的外界干擾更小。

表4 [(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相法與緩沖液法、[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法萃取SOD效果比較結果Table 4 Comparison of SOD activity values determined by [(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4-based two aqueous phase extraction, buffer solution extraction and[C4Mim]Br/K2HPO4-based two aqueous phase extraction

3 結 論

本研究基于[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相體系，建立了萃取分離番茄中SOD的新方法。以SOD活力為指標，對離子液體的種類及質量濃度、萃取時間、無機鹽質量濃度、萃取溫度等條件進行了優化，并根據單因素試驗結果設計響應面試驗，最后對傳統緩沖液法及[C4Mim]Br/K2HPO4雙水相法進行萃取效果的比較。結果表明[(H2NC2)Mim]Br/K2HPO4雙水相法萃取番茄中SOD的最佳條件為[(H2NC2)Mim]Br離子液體質量濃度0.40 g/mL、K2HPO4質量濃度0.60 g/mL、萃取溫度35 ℃、萃取時間25 min。通過本研究建立的萃取方法成功萃取了番茄中的SOD，得到的SOD活力比傳統緩沖液萃取方法高，且萃取時間縮短了15 min。