艾滋病的檢測技術及其研究進展

李海梅 周月蘭 羅必泰 林丹英

（南寧中心血站，廣西 南寧，530000）

艾滋病也被稱為獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所致，經相關研究表明，HIV 感染可以直接破壞人體的免疫細胞，造成機體的免疫功能缺陷，從而增加各種機會性感染和腫瘤的發生風險，增加感染者的病死率[1]。此外，該病毒的傳染途徑較多，血液、母嬰和性接觸均可造成AIDS 的傳播，對公眾健康構成嚴重威脅。目前，遏制AIDS 傳播的關鍵在于提高HIV 的檢測率以及對感染者采取有效的治療措施，其中HIV 的檢測方式主要以實驗室檢測為主，包含HIV 抗體檢測、病原學檢測、HIV 核酸檢查和CD4+檢測等多種方式[2]。現筆者就艾滋病檢測技術的研究進展進行綜述，為提高HIV 的檢測率，遏制AIDS 傳播提高相關參考。

1.HIV 抗體檢測

HIV 抗體檢測多為初篩試驗，主要可包含酶聯免疫吸附試驗、化學發光試驗、免疫熒光試驗、明膠顆粒凝集試驗以及HIV自行檢測等多種方式，但在實踐操作的過程中標本的采集、試劑選擇和處理、溫度調控、操作人員技術等多個方面均可檢測結果產生影響。故而為提高臨床檢測的準確率還可對HIV 抗體進行補充試驗[3]。目前，HIV 抗體確證實驗是對樣品中血清學檢測為HIV 抗體呈陽性反應結果的最終評價，其方式包括免疫印跡法（WB）、條帶免疫印跡法（SIA）、免疫熒光法（IFA）和放射免疫沉淀法（RIPA），其中WB 是國內HIV 抗體確證實驗的首選方式，在晏征[4]等研究發現，對3494 份HIV 抗體篩查有反應標本進行WB 確證試驗發現，HIV-1 抗體陽性標本1822 份（52.15%）；HIV 抗體不確定標本416 份（11.91%）；HIV 抗體陰性標本1 256 份（39.95%），由此可見WB 法作為HIV 抗體檢測的“金標準”，其穩定性、特異性、準確性已得到廣泛認可，可以準確判斷AIDS 病毒感染。

2.HIV 病原學檢測

HIV 病原學檢測可分為p24 抗原檢測和病毒培養兩種，其中前者可將HIV 的感染窗口期縮短至近1 周，在HIV 的早期診斷中具有較高的應用價值，現國外多將其用于獻血人員的篩查，然而該檢測方式敏感性較低，只適用于部分早期感染患者和AIDS 晚期患者，臨床的應用并不廣泛；而從HIV 感染者的細胞、組織和體液中分離出的病毒是感染確認的最可靠診斷，對不同階段的感染者HIV 的分離率可高達90%以上，但該實驗的實施需要在生物安全P3 級的實驗室進行，技術要求高，價格昂貴，目前僅限于研究中使用。

3.HIV 核酸檢測

3.1 HIV 核酸定量檢測

當人體感染HIV 后，病毒會在體內快速復制，通過對血漿的檢測可以測定病毒載量（VL），并且從病毒RNA 中提取核酸，通過擴增或放大信號可以使其檢測范圍大約控制在40～107 拷貝/ml，提高VL 測定的準確性，經段星[5]等研究證實，血漿病毒載量在5000 拷貝/ml 以上時，核酸定量檢測試驗對于HIV-1感染陽性樣本是一種有效的實驗室診斷方法，此觀點已被正式納入艾滋病檢測技術規范中。如今，臨床常見的定量檢測方式包括反轉錄PCR、核酸序列依賴性擴增技術（NASBA）和支鏈DNA信號擴大系統。反轉錄PCR 屬于目標核酸擴增法，是血液篩查和HIV 病毒研究中應用最廣泛的定量檢測方式，其中雅培Real time HIV-1 PCR 和羅氏Cobas Taq-Man 兩種檢測方法應用最廣泛，它們均由制造商提供專有的自動血漿RNA 處理器和擴增/檢測設備進行檢測，整個時長大約需要6～8h。NASBA 同樣屬于目標核酸擴增法，主要是借助系統內的混合酶系統體外模擬反轉錄病毒在細胞 內的復制過程從而進行測定，該方式在A～G 各亞型中均有較高的反應性，且適用各種抗凝劑，但在樣品的提取和反應的測定過程中需要依賴大量手工操作。而支鏈DNA 信號擴大系統屬于直接檢測法，無需對RNA 進行提取和純化，單純通過被檢樣品和外部標記的反應強度來確定病毒RNA 含量，不僅具備較高的敏感性，還可重復操作；但因缺乏內部質控，難以有效控制在提取和加樣過程中的操作失誤，并且對血清和血漿以外的其他體液樣本無法檢測。

3.2 HIV 核酸定性檢測

HIV 核酸定性檢測主要適用于急性HIV 感染的輔助診斷，同時在感染HIV 的母親所生育的孩子感染情況的輔助診斷和血清學檢測結果不確定的情況下也可采用該項檢測方式，具體可分為原位雜交、定性HIV 前病毒DNA 檢測以及HIV-RNA 檢測三種手段，其中前者的敏感性較低，而后兩者的敏感性較高。經羅慧景[6]研究證實，對217 份HIV 陽性母親所生嬰兒的待檢足底血干血斑（DBS）樣本分別采用In-house 方法與商品化雅培RealTime 艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）定性檢測試劑盒檢測，結果顯示兩種檢測方式的一致率為98.6%，Kappa 值為0.835，95%CI 為0.652～1.000，P＜0.05，由此可見，定性HIV 前病毒DNA 檢測方式具有較高的應用價值。

4.CD4+T 淋巴細胞計數檢測

在麻秋英[7]等研究中發現，HCMV-DNA 陽性的HIV/AIDS 患者，其CD4+T 淋巴細胞水平較血尿陰性患者明顯降低，由此可見，HIV 感染人體后最先攻擊的是CD4+T 淋巴細胞。臨床對此細胞亞群的檢測方式主要以流式細胞術檢測為主，該方式可以直接獲取CD4+T 淋巴細胞的絕對值，從而了解感染者機體的免疫狀態和病程進展[8]。目前臨床將HIV 感染的CD4+T 淋巴細胞的數目大致可分為≥0.5*109/L、（0.2～0.5）*109/L 和＜0.2*109/L 三個等級，對于確定感染者的疾病分期、可能發生的臨床并發癥以及治療效果的判斷均有較高的應用價值[9]。

5.HIV 耐藥檢測

隨著我國艾滋病患者數量的不斷增加，高效抗逆轉錄病毒的治療已逐漸普及，隨之而來的則伴有單一或多種耐藥菌株開始傳播，故而耐藥性檢測現已成為HIV 感染患者抗病毒治療管理中不可或缺的手段。目前，臨床較為成熟且已經應用于臨床的實驗方法包括HIV 基因型耐藥檢測以及表型耐藥檢測。前者是通過檢測病毒耐藥性的相關序列來判斷病毒株的耐藥情況，具體包含DNA 序列分析法、分子雜交分析法、干血斑技術等，其在臨床實踐的過程中具有簡單、快速且費用低的優勢，而干血斑技術作為一種易采集、易保存、生物危險性低等方式，在實驗設備較差的偏遠地區以及難采血的患者中具有較高的應用價值。但上述方式在應用過程中如何合理、正確的解釋檢測的突變結果，評價對HIV-1 耐藥性的作用則成為臨床需要考慮的問題。表型耐藥性檢測主要是用于檢測病毒在各種抗逆轉錄藥物濃度的生長能力，通過檢測抑制50%和90%病毒復制的藥物濃度，再將重組病毒與野生毒株的藥物濃度進行對比，從而對耐藥性進行判斷，目前，臨床常見的檢測方式包括基于真病毒的表型耐藥性檢測、基于假病毒的表型耐藥性檢測、快速耐藥性表型檢測以及虛擬表型檢測等[10]。

6.總結

綜上所述，臨床適用于AIDS 診斷的檢測技術較多，除了上述的HIV 抗體檢測、病原學檢測、HIV 核酸檢查、CD4+檢測技術及HIV 耐藥檢測外，還可通過血常規生化檢測和耐藥性監測等多種檢測方式進行診斷，不同的檢測方式均具備各自的優勢及劣勢，但相比之下，HIV 核酸檢測的方式具有窗口期短、靈敏度高的優勢，對于AIDS 的早期診斷、病程檢測、抗病毒治療效果評價等具有較高的意義，而在今后的發展中也應以提高檢測靈敏度、特異性，降低漏檢率、加快檢測速度、確保操作簡單方便，并且還可以降低檢測成本，滿足基本醫療機構的檢測需求為主要目標。