牛病毒性腹瀉病例的血清學診斷

連小麗

（甘肅省定西市安定區畜牧獸醫局高峰畜牧獸醫站 743000）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）隸屬于黃病毒科，是瘟病毒屬成員之一，主要引發病毒性腹瀉-黏膜病，以致病牛免疫耐受能力降低、屢次出現感染、母牛流產風險明顯增高、奶牛產奶量下降，對牛只健康生長造成嚴重影響。病畜分泌物、排泄物及血液等均可能成為本病的傳染源，既往調查發現[1]，牛病毒性腹瀉在全國范圍中均可發生，有廣泛流行性特征，對牛養殖戶經濟效益形成較明顯的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清

2019 年在內蒙古某奶牛場隨機選擇300 頭牛，采集尾靜脈血液，常規離心、分離血清后待檢。已知本牛場所有牛既往均沒有接種過BVDV 疫苗。

1.1.2 檢測試劑

牛病毒性腹瀉抗體（BVDV-Ab）、抗原（BVDV-Ag）檢測試劑盒。

1.1.3 主要儀器設備

高速臺式離心機（5810）、恒溫培養箱（INE 500）以及酶標儀（Elx808IU）等。

1.2 檢測方法

采用酶聯免疫試驗（ELISA）方法檢測BVDV-Ab、BVDVAg，嚴格依照試劑盒說明書上指示內容進行操作。

（1）把試樣對應的微孔按序編號，各板均要設置陰性、陽性對照孔，空白對照孔，其中空白對照孔不添加試樣于酶標試劑，其他各步操作一致。

（2）將50μl 陰性、陽性對照分別添加到陰、陽性對照孔，而后先把樣品稀釋液40μl 添加到待測樣品孔，而后再加入10μl 待測樣品。通過加樣把試樣添加到酶標板孔底，盡量做到不觸碰孔壁，輕搖使其混合均勻。

（3）采用封板膜進行封板處理后，將其安放在37℃恒溫箱內，連續孵育30min。

（4）小心撕掉封板膜，棄除液體，甩干，各孔加滿洗滌液，靜置30s 后棄除，以上操作反復進行5 次，拍干。

（5）朝各孔添加50μl 酶標試劑（空白孔除外），孵育及洗滌反復同上。

（6）每孔各添加50μl 顯色劑A，隨后添加50μl 顯色劑B，輕搖混勻，37℃避光條件顯色15min。

（7）各孔均添加50μl 終止液，終止反應（此時藍色立即轉變為黃色）。

1.3 指標觀察與判斷

把空白孔調零，采用450nm 波長依次檢測各孔的吸光度（OD 值），檢測要在添加終止液15min 之內進行。

試驗有效性判斷標準為：陽性、陰性對照平均值分別≥1.00、≤0.10[2]。

臨界值（CUT OFF)=陰性對照孔均值=0.15，若試樣OD值≥臨界值（CUT OFF) 則被診斷為BVDV 陽性，否則為BVDV 陰性。

2 結果

2.1 統計牛病毒性腹瀉抗體/抗原感染情況

300 份牛血樣均順利完成牛病毒性腹瀉抗體與抗原檢測，統計發現，BVDV-Ab、BVDV-Ag 陽性率分別是7.00%（21/300）、0.67%（2/300）。表明該牛場中存在牛病毒性腹瀉感染情況，和全國既往報道的數據相比較，感染率相對較低。

2.2 陽性牛群內牛病毒性腹瀉抗體/抗原的轉換值

參照試劑盒說明書，BVDV-Ab 轉換值≥0.300 與BVDVAg 轉換值＞0.300 時分別被判斷為陽性。參照以上情況，進一步分析BVDV-Ab、BVDV-Ag 顯陽性的試樣發現，BVDV-Ab、BVDV-Ag 轉換值的平均值分別為0.900 與3.302，明顯高于判定陽性的臨界值，表明本牛場確實存在牛病毒性腹瀉感染情況。

3 討論

牛病毒性腹瀉是由BVDV 引起的一種牛群接觸性傳染疾病，其臨床癥狀多樣，且時常變化，如體溫升高、黏膜發炎、糜爛、壞死、腹瀉、流產等。本病在全國各地均有發生，感染對象以黃牛、水牛與牦牛等為主，冬末與春天是本病高發期，新發病牛只呈現出爆發流行，發病后能獲得較長期的強免疫，呈現出零星散發[3]。患病牛與帶毒牛是本病主要傳染源，患病牛只的鼻汁、唾液、糞尿等分泌物與排泄物中均可含有大量BVDV，一般會通過消化道與呼吸道感染傳播本病。各年齡段的牛只均可能會感染本病，其中6～18 月齡的牛感染率相對較高，山羊與豬等可能會自然感染，形成抗體，但基本不會出現明顯的癥狀表現，呈現出隱性感染，牛群內存在較高的感染率。

針對畜病的發病原因，可能是牛種引進前沒有進行嚴格的隔離、檢疫，以致帶進BVDV；病牛自身攜帶病毒、處理不規范、消毒不徹底，飼養管理欠缺規范性等。針對本病癥的獸醫診斷要點有：幼齡牛與青年牛染病后體溫上升，達到41～42℃，持續高熱4～7d，食欲減退或廢食，反芻暫停，口周流涎，流眼淚，奶牛泌乳性能下降，口腔黏膜出現不同程度潰爛及消化道出血與潰瘍等，特別是食道黏膜腐爛，結合病畜以上癥狀表現，通常能初步作出診斷。而若要作出最后診斷，需要病原學和血清學檢查。其中血清學診斷過程需要提取疑似病例的血液標本，檢測時可供選擇的方法較多，如ELISA 方法、中和試驗等[4]。相關人員要認真觀察試驗結果，采集病畜相應情況，疾病一經確診后應立即采取對癥治療方法。在本次檢測中，采用ELISA 方法檢查300 份牛血樣，牛病毒性腹瀉抗體與抗原陽性率分別是7.00%、0.67%，表明該牛場中存在牛病毒性腹瀉感染情況。計算陽性牛群內牛病毒性腹瀉抗體/抗原的轉換值，平均值分別是0.900 與3.302，明顯高于判定陽性臨界值，表明本牛場確實存在牛病毒性腹瀉感染情況。

當下，獸醫臨床上針對牛病毒性腹瀉尚沒有根治手段與免疫方法，針對患病牛只，只有在加強監測、照護、飼養管理來增強牛只機體抵抗力，結合癥狀表現采用對癥治療手段。針對病情相對較嚴重的養牛場，可以應用注射本病弱毒疫苗的方法，該種方法不適用于健康牛與妊娠牛只。通過加強各種規范化的飼養管理措施去增強牛的抵抗能力。養殖戶自覺樹立定期消毒意識，可以選擇過氧乙酸、3.0%火堿、聚維碘等對養殖環境進行消毒處理。有報道指出[5]，豬瘟弱毒疫苗在防治本病黏膜型病畜方面表現出良好的效能，具體在公牛配種前30d，母牛臨產前30d 各頭均肌肉注射10 頭份，而后每間隔10～12 個月注射1 次，小牛犢在1～3 月首免（3 頭份），6～8 月后再進行免疫1 次。針對無病癥的養殖場，要定期采用血清學監測方法進行凈化，針對發病牛群及時進行隔離治療，最好應用撲殺方法，并且要予以無害化處置。在購置種牛、飼料過程中要加大檢查力度，尤其是跨區域、跨省運調牛種，規避養殖區中出血病牛或帶有BVDV 的牛。