牦牛與犏牛睪丸組織轉錄組、蛋白組比較研究進展

曹夢麗 宋仁德 李吉葉 郭憲*

（1，中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室 730050；2，青海省玉樹州動物疫病預防控制中心 815000；3，青海省大通種牛場 810102）

牦牛（Bos Grunniens）屬于哺乳綱偶蹄目牛科牛屬，是青藏高原及其毗鄰地區的主導牛種，其抗逆性強，能極好的適應高原的惡劣環境。可為當地牧民提供肉、奶、毛、役力、燃料等生活必需品，是高寒地區畜牧經濟中寶貴的遺傳資源，具有不可替代的地位，被譽為“高原之舟”[1]。犏牛是牦牛與黃牛的雜交后代，具有明顯的雜種優勢[2]，既對高海拔、低氣壓、低溫等惡劣環境具有較強適應性，又能適應海拔較低、氣溫較高的地區，同時乳、肉生產能力、役用能力均優于牦牛。但由于物種間存在生殖隔離，使得犏牛雄性不育，極大阻礙了犏牛優良性狀的穩定遺傳，所以，研究其不育機理具有重要的理論和現實意義。目前，關于牦牛、犏牛睪丸組織的相關研究已成為牦牛改良和提高牦牛種用性能的研究熱點，本文對近8 年來關于牦牛與犏牛睪丸組織轉錄組及蛋白組的比較研究進行歸納總結，旨在為提高牦牛種用性能和犏牛雄性不育研究提供基礎資料。

1 轉錄組比較研究

1.1 轉錄組學主要研究方法

轉錄組學是指生物體某一生理條件下細胞或組織內表達的基因的總和，通過轉錄組分析，基因的結構和功能可在整體水平上進行研究以發現所涉及的特定生物學過程。隨著組學的快速發展，基因芯片技術、基因表達序列分析技術及大規模平行測序技術等轉錄組研究方法已被轉錄組測序技術替代。以Sanger 測序法為代表的笫一代測序技術主要特點是準確率高達99.999%，但讀長（Reads）長度僅為700～900bp，設備運行時間短，適用于通量要求低的快速研究項目，一個反映僅能得到一條讀長，且大規模測序成本較高，一般適用于少量樣本的小規模測序[3]；第二代測序技術主要有Roche 公司的454 技術、illumina 公司的Solexa 技術和ABI 公司的SOLID 技術，為高通量測序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測序，讀長短，但reads 數量巨大，適合用作表達定量，且單條序列成本非常低廉，適用于大規模高通量的測序需求，現在仍是科研市場的主力平臺[3]；第三代測序技術以PacBio 公司的SMRT 和Oxford Nanopore Technologies 的納米孔單分子測序技術主流，該技術能在單核苷酸水平上檢測物種的整體轉錄活動，并且可以識別和量化剪接類型并進行堿基修飾檢測，具有操作步驟簡單、通量高，成本低，靈敏度高等優點。RNA-seq 可直接分析生物體的整個轉錄組，也可用于未知的基因組序列分析，得到廣泛應用。近年研究人員通過RNA-seq 比較牦牛與犏牛睪丸組織轉錄組差異，為更好地了解犏牛生精障礙的原因，為揭示犏牛雄性不育機理提供了基礎信息。

1.2 在牦牛犏牛科學研究中的應用

1.2.1 編碼RNA

曾賢斌[4]采集牦牛和犏牛（各5 頭）個體的睪丸組織，制成2 組睪丸組織混合樣，用RNA-Seq 測序技術對其進行測序和比較分析，研究表明，牦牛、犏牛睪丸中分別有18529 和17784 個基因表達，犏牛睪丸組織中表達顯著上調基因有5000個，顯著下調基因有4089 個；其睪酮合成的相關基因和抑制素基因表達均顯著上調；與性染色體間的聯會復合體數量有關的Syce3、Fkbp6、Dmrt7 等基因表達極顯著下調，參與雙鏈斷裂和同源修復過程的Spo11、Dmc1 基因表達下調，參與高度濃縮細胞核的相關基因，尤其是Tnp2、Hmgb4 和H1fnt 等幾乎不表達，調控基因Crem、GRTH/DDX25 等極顯著下調表達；p53、TNF-α、Trail、Bmp8b、Bax、Caspase-3、Caspase-6 和Caspase-7 等凋亡相關基因表達均顯著上調，而抑凋亡基因survivin、Bcl-2 等顯著下調。由此可見，犏牛睪丸組織中的高表達基因大多參與蛋白合成及細胞凋亡活動，而參與精子生成的基因低表達或不表達。

楊芳[5]基于RNA-Seq 技術對12 月齡的牦牛和犏牛（各3頭）個體的2 份睪丸組織樣進行測序和比較分析，結果顯示：共得到2960 個差異表達基因，犏牛睪丸組織樣中679 個基因表達上調，2281 個基因表達下調；GO 富集分析差異表達基因發現了與精子發生相關的大量基因下調，與減數分裂相關基因CDKN2C、CYP26A1、OVOL1、GGN、MAK、INSL6、RNF212、TSSK1B、TSSK2、TSSK6 下調使減數分裂過程中精子發生阻滯加劇，與精子結構組分相關基因PRM2、ODF3 下調，導致精子形態異常；PATHWAY 富集分析差異表達基因Wnt/β-catenin 參與的信號通路中Wnt3a、PP2A、TCF/LEF-1 等基因的下調導致犏牛精原干細胞分化受阻。該研究從精原干細胞分化、精子發生及精子形態結構方面闡明犏牛雄性不育的機制。

Wu 等[6]利用高通量測序技術對12 月齡牦牛和犏牛（各3頭）個體睪丸組織轉錄組進行了比較分析，結果表明，共鑒定出差異表達6477 個，其中2919 個上調，3558 個下調，大多數差異表達基因與有絲分裂和細胞周期進程有關，參與膠原纖維組裝、細胞黏附和細胞外基質相互作用的基因上調可能阻礙了精細胞從基底部向管腔的移動。

上述研究探究了牦牛、犏牛睪丸組織編碼RNA 表達差異，對與激素調節、精子發生、精原細胞分化及細胞凋亡相關基因進行了分析，通過相關分析得出犏牛精子發生阻滯開始于精原細胞分化階段，減數分裂階段加強，精細胞在移動中受阻，后期精子形態及結構異常。為揭示犏牛雄性不育機理提供了基礎資料。

1.2.2 非編碼RNA

廖珂[7]采集牦牛、普通牛和犏牛（各3 頭）成年個體的睪丸組織構建miRNA 文庫構建并測序，結果表明，3 個文庫中共有580 個miRNA，三者均表達的有439 個，牦牛、普通牛、犏牛差異表達分別是9、10、69 個；犏牛與牦牛文庫相比，表達極顯著上調和下調的分別有312 個、11 個，與普通牛文庫相比，表達極顯著上調和下調分別是321 個、8 個；犏牛睪丸組織中表達量較高的miRNA（bat-miR-125a、bat-miR-125b、bat-miR-26a、bat-miR-26b）調控靶基因涉及細胞凋亡機制，可能與其精子發生阻滯相關；差異表達miRNA 的靶基因主要參與了4 種富集通路，分別是細胞凋亡信號通路、促性腺激素釋放激素受體通路、Wnt 信號通路以及轉化生長因子-β 信號通路。

徐傳飛[8]通過比較分析12 月齡的牦牛和犏牛（各3 頭）個體的睪丸組織miRNA 文庫的差異發現了已知的50 個miRNA差異表達顯著，上調和下調分別是11 個、39 個、11 個新的miRNA 差異表達顯著，上調和下調分別是8 個、3 個，其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378 和miR-184 參與精原干細胞自我更新及分化過程，miR-34c、miR-449a 參與減數分裂起始過程；確定了13 個差異表達的已知miRNA 的50個假定靶標和6 個差異表達的新miRNA 的30 個假定靶標，發現差異表達miRNA 靶基因主要富集通路是G 蛋白偶聯受體信號通路及核糖體結構成分。

Wang 等[9]等利用高通量測序技術對牦牛、普通牛和犏牛各3 頭成年個體睪丸組織的miRNAs 和piRNAs 進行了分析，得到普通牛和犏牛、普通牛、牦牛以及牦牛和犏牛的差異表達miRNA 分別為119 個、14 個、6 個，差異表達piRNA 分別是873 個、1065 個、1158 個，提示在犏牛中非編碼RNA 的表達調控可能與其精子發生有一定關聯。

伍仕鑫[10]對（12±1）月齡的牦牛和犏牛各3 頭個體的睪丸組織進行了轉錄組測序，篩選出604 個差異表達的lncRNA，在犏牛睪丸組織中顯著性高表達和低表達分別是135 個、469個；差異表達lncRNA 的靶基因主要參與犏牛生精分裂的起始、細胞周期進程、DNA 復制、同源重組、細胞內吞、生長、分化及凋亡等信號通路及生物學過程，其中PCNA、PPP2R5C、CDK1、BRCA1、RPA2、CLSPN、CCNB1、TEX14 和CDC45 等大量靶基因參與有絲分裂細胞進程，在犏牛中下調表達。

阿果約達等[11]等采用RNA-Seq 測序技術對3～4 歲的牦牛（3 頭）和犏牛（3 頭）的睪丸組織進行了轉錄組測序，結果表明，分別得牦牛、犏牛lncRNA 轉錄本20363 個、24133 個，篩選出6178 個顯著差異lncRNA，與牦牛相比，犏牛睪丸組織上調和下調分別是2470 個、3708 個；篩選得到差異顯著lncRNA 的候選靶基因2676 個，主要富集通路包括軸突指導、內吞、Hedgehog 等信號通路，一些lncRNA 介導的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11與犏牛雄性不育有關。

上述研究篩選出了牦牛、普通牛和犏牛睪丸組織的差異非編碼RNA，并對其靶基因進行通路和基因富集分析，這些靶基因主要涉及DNA 復制過程損傷的檢測及修復、細胞周期進程的調控、細胞黏附、遷移、免疫、代謝等信號通路，并具有核酸、蛋白質結合功能，表明這些非編碼RNA 可調節精原干細胞分化、精子形成及精細胞凋亡等生物學過程。這些研究為更好地了解犏牛生精障礙的原因，揭示犏牛雄性不育機理提供了基礎信息。

2 蛋白組比較研究

2.1 蛋白質組學主要研究方法

蛋白組學研究方法主要包括蛋白質分離、定量、鑒定。分離技術主要有雙向凝膠電泳、雙向熒光差異電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細吸管電泳、高效液相色譜和二維液相色譜等；定量技術主要有蛋白質非標記定量技術（Label Free）、相對和絕對定量同位素標記（iTRAQ）等，鑒定技術主要有肽質量指紋圖譜等，酵母雙雜交技術用于鑒定蛋白質與蛋白質之間的相互作用。定量蛋白質組是把一個基因組所表達的全部蛋白或者是一個復雜體系所有的全部蛋白進行鑒定和定量的方法。其中Label Free 用于分析不同組織或細胞之間的蛋白相對差異，i-TRAQ 利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N 末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較8 種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。目前，蛋白質組學研究方法已應用于牦牛犏牛比較科學研究中。

2.2 在牦牛犏牛科學研究上的應用

付偉等[12]等采集健康成年牦牛(n=4)、犏牛(n=2) 的睪丸組織，應用雙向電泳-質譜技術對牦牛和犏牛的睪丸組織中差異蛋白質進行分離和鑒定，共獲得差異蛋白19 個，其中表達量相當的蛋白2 個，與牦牛相比犏牛睪丸組織13 個差異蛋白低表達，4 個差異蛋白上調；發現T-復合蛋白、肽酰脯氨順-反異構酶D、鐵蛋白均有分子伴侶活性，且在犏牛睪丸組織中表達偏低，山梨醇脫氫酶是多元醇代謝通路的關鍵酶，該通路是精子獲能的重要來源，在犏牛中低表達可能與雄性不育有關。

屈兵兵等[13]提取健康成年牦牛（n=9）、犏牛(n=7) 睪丸組織總蛋白，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參，采用Westernblot 技術檢測影響生殖活動的磷酸酶甲酯酶-1 (PPME1）在牦牛和犏牛睪丸組織中的相對表達水平，結果表明，PPME1 在犏牛睪丸組織中的表達水平顯著低于牦牛，相差約14 倍，說明PPME1 在犏牛睪丸中的低表達可能與其雄性不育存在關聯。

Yu 等[14]采集12 月齡的牦牛和犏牛（各3 頭）的睪丸組織，應用iTRAQ 法對其蛋白組進行比較研究，共鑒定出顯著差異表達蛋白256 個，與牦牛相比，犏牛睪丸組織88 個蛋白表達上調，168 蛋白表達個下調；排在前四位的上調蛋白分別是PTX3、S-100、H1.0 和Osteoglycin，排在前四位的下調蛋白是MHC class II、Ropporin-1、SNRPF protein 和Protamine 2，研究結果表明，大量上調蛋白可能參與應激反應、增強生精細胞間粘附性及抑制生精細胞從基底膜向生精小管管腔的遷移，許多下調蛋白與精子發生相關。

Sun 等[15]同樣采用iTRAQ 方法對不同發育階段的犏牛（10、12、14 月齡）睪丸蛋白組進行了差異分析，鑒定出12 月齡與10 月齡之間差異蛋白318 個，14 月齡與10 月齡之間差異蛋白327 個，兩種對比下的差異蛋白GO 注釋沒有明顯差異。

上述研究探究了牦牛、犏牛睪丸蛋白組表達差異，獲得了一批表達差異明顯的蛋白質，這些差異蛋白在細胞生長、細胞周期、精子發生等方面可能發揮重要作用，對不同發育階段的犏牛睪丸蛋白組進行分析，證明了犏牛早期發育過程中睪丸生精能力就受到阻滯。

隨著組學技術的發展，目前對犏牛雄性不育相關研究在睪丸轉錄組上已獲得初步成果，探究了牦牛、普通牛、犏牛3 種牛睪丸組織轉錄組差異，找出了與精子發生、精原細胞分化及精細胞凋亡等相關基因及非編碼RNA 的表達差異，為了更好地了解犏牛生精障礙的原因，為揭示犏牛雄性不育機理提供了基礎信息。目前，蛋白質組學已經廣泛應用于植物雄性不育等領域。但有關犏牛雄性不育的因果關系仍不清楚，尤其缺乏蛋白質水平的研究。因此，在現有科學研究進展基礎上開展牦牛犏牛轉錄組蛋白組比較研究，有助于在理論上突破犏牛雄性不育生殖障礙。