白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用研究＊

周心晨，但彩云，崔詩遙，李文樂，劉 雪，李聰慧，時連根

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

白僵蠶（Bombyx batryticatus）是蠶蛾科家蠶（Bombyx mori）幼蟲感染白僵菌（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）后致死的干燥菌蟲復合體，也稱僵蟲、天蟲、姜蟲等，始載于《神農本草經》，是我國一味傳統的珍貴中藥材［1～3］，其用藥標準收載于《中國藥典》2020年版一部［4～15］。白僵蠶有息風止痙、祛風止痛、化痰散結等功效，臨床用于治療肝風夾痰、驚癇抽搐、小兒急驚風、破傷風、中風口、風熱頭痛、目赤咽痛、風疹瘙癢、發頤痄腮等疾病?，F代藥理學研究證實，白僵蠶富含黃酮類、白僵菌素、多糖類等多種活性成分，具有抗驚厥、抗凝血、抑菌、抗腫瘤、降糖降脂、抗氧化等作用。白僵蠶的抗氧化作用是當前研究熱點之一，國內外學者報道了白僵蠶抗氧化成分提取的多種技術工藝［16，17］，但對提取溶劑濃度影響提取物的抗氧化缺乏研究，這阻礙了白僵蠶抗氧化功能的開發利用。本文用不同濃度乙醇對白僵蠶進行回流提取，通過抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羥基（·OH）自由基和總還原力試驗，比較白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 供試白僵蠶粉及主要試劑和儀器

取5齡起蠶，均勻噴灑濃度為1.0×105分生孢子/mL的家蠶病原白僵菌分生孢子液，于25℃、90%濕度條件下飼養48 h后，于常規條件下飼養，4 d～5 d后蠶陸續發病僵死，收集僵死蠶于25℃、90%濕度條件下培養，直至蠶體覆滿白色的白僵菌分生孢子，收集白僵蠶并于35℃烘箱中烘干，中藥粉碎機粉碎后過100目篩，制成白僵蠶粉，-20℃冰箱保存備用。

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）；METTLER TOLEDO AB104-N天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；恒溫恒濕培養箱（Safe公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械股份有限公司醫療器械五廠）；YQ-1002C型超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）；Free zone 6 plus冷凍干燥器（Labconco公司）；RE52CS旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；UV2450紫外分光光度儀（日本島津公司）。

無水乙醇、抗壞血酸（VC）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、七水合硫酸亞鐵、雙氧水（H2O2）、水楊酸等化學試劑均為分析純，購自中國醫藥上?；瘜W試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為Sigma公司產品。

1.2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的制備

采用超聲波輔助乙醇回流提取法。稱取三份等質量白僵蠶粉末，按1∶10的料液比（質量體積比，g/mL），分別緩慢加入體積分數為65%、80%和95%的乙醇，混勻后，在常溫下用超聲波清洗儀超聲（功率60%、頻率53 kHz）處理30 min，然后于60℃水浴鍋中回流提取2 h；收集提取液，抽濾，濾液置旋轉蒸發儀減壓濃縮，得到白僵蠶不同濃度乙醇提取濃縮液；將濃縮液入冷凍管并封口，置于-80℃冰箱過夜保存；取出冷凍管，快速置于冷凍干燥機中于-50℃下真空干燥，得到白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物。

1.3 DPPH自由基清除試驗

參考胡碧君報道的方法［18］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；取樣品液2 mL，加入等體積的0.04 mg/mL DPPH溶液（用提取時相對應濃度乙醇配制）（Ai），并設加入等體積的提取時相對應濃度乙醇液替換DPPH溶液（Aj），混勻后在室溫下遮光反應30 min；取上清液在波長517 nm下測定吸光度，試驗重復三次，設置抗壞血酸為陽性對照組，雙蒸餾水替換樣品液為空白對照組（A0）。按下列公式計算DPPH清除率（SE）：

式中：SE為清除率；Ai為2 mL DPPH+2 mL樣品液的吸光值；Aj為2 mL相對應濃度乙醇+2 mL樣品液的吸光值；A0為2 mL DPPH溶液+2 mL雙蒸餾水的吸光值。

1.4 羥基自由基清除試驗

參考胡碧君報道的方法［18］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；取樣品液1 mL，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻后靜置10 min；加入6 mmol/L水楊酸溶液（顯色劑）1 mL（Ai），并設加入1 mL雙蒸餾水替換水楊酸溶液（Aj），混勻后37℃水浴鍋中反應30 min；取上清液在波長510 nm下測定吸光度，試驗重復三次，設置抗壞血酸為陽性對照組，雙蒸餾水替換樣品液為空白對照組（A0）。按下列公式計算清除率（SE）：

式中：SE為羥基自由基清除率；Ai為樣品液+FeSO4+H2O2+水楊酸的吸光值；Aj為樣品液+Fe?SO4+H2O2+雙蒸餾水的吸光值；A0為雙蒸餾水+Fe?SO4+H2O2+水楊酸的吸光值。

1.5 還原能力測定

參考范金波等報道的方法［19］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；依次向離心管中加入0.75 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、樣品液0.75 mL、1%鐵氰化鉀溶液0.75 mL，混勻后于50℃水浴鍋中反應20 min；取出離心管，加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混勻后于室溫下3000 rpm離心10 min；取上清液1.5 mL入試管中，再加入雙蒸餾水1.5 mL和0.1% FeCl3溶液0.1 mL，在波長700 nm下測定吸光度，吸光度越高代表樣品還原能力越強，試驗重復三次。

1.6 數據統計分析

采用Excel和SPSSAU v21.0對試驗數據進行統計分析，處理間差異采用LSD（Least Significant Dif?ference）法比較，P＜0.05表示差異達顯著水平，P＜0.01表示差異達極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對DPPH自由基清除活性的比較

測定白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率，結果如圖1所示。圖1顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物在濃度0～0.2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率均是隨著濃度提高而逐漸增大，并且均表現出較好的正相關關系；在低濃度時，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提物對DPPH自由基的清除率顯著低于VC，但隨著濃度的升高，VC對DPPH自由基的清除率趨于穩定，使白僵蠶65%、80%、95%乙醇提物與VC的清除率差距逐漸縮小。通過SPSSAU v21.0計算得到，白僵蠶65%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=277.994x+48.757，其半抑制濃度IC50為4.471 μg/mL；白僵蠶80%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=279.326x+48.906，其半抑制濃度IC50為3.916 μg/mL；白僵蠶95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=157.757x+46.419，其半抑制濃度 IC50為 22.7 μg/mL。結果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對DPPH自由基均表現出較強的清除作用，其清除活性為白僵蠶80%乙醇提取物＞白僵蠶65%乙醇提取物＞白僵蠶95%乙醇提取物。

圖1 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對DPPH自由基的清除活性Fig 1 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Dpph Radicals

2.2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對羥基自由基的清除活性比較

檢測白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對羥基自由基（·OH）的清除作用，結果如圖2所示。圖2顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物濃度在0～0.2 mg/mL范圍內，其對羥基自由基的清除率均隨濃度增大而升高，濃度與清除率間均表現出良好的量效關系；在低濃度時，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對羥基自由基的清除率與抗壞血酸對照組的差距均較大，但隨著濃度的增大，其間的差距逐漸縮小。通過SPSSAU v21.0計算得到，白僵蠶65%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=16.251x+80.475，白僵蠶80%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=13.864x+70.829，白僵蠶95%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=53.197x+40.021，抗壞血酸的清除率-濃度曲線公式為y=14.296x+88.934。以抗壞血酸0.1 mg/mL時的清除率90.48%為參考量，根據以上公式計算可得：1 g白僵蠶65%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當于162.43 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶80%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當于70.55 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶95%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當于105.43 mg抗壞血酸。結果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對羥基自由基均表現出較強的清除作用，其中白僵蠶65%乙醇提取物的清除活性最強，白僵蠶95%乙醇提取物清除活性次之，白僵蠶80%乙醇提取物的清除活性最弱。

圖2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對羥基自由基的清除活性Fig 2 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Hydroxyl Radicals

2.3 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的還原能力比較

檢測白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物的總還原力，結果白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物濃度在0～0.6 mg/mL范圍時，其吸光值均隨濃度增大而穩步上升，并且濃度與吸光值間均表現出顯著的正相關系（相關系數R2均大于0.995）。通過SPSSAU v21.0計算得到，白僵蠶65%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.491x，白僵蠶80%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.496x-0.002，白僵蠶95%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.231x+0.001，抗壞血酸對照組的線性回歸公式為：y=6.638x+0.111（R2=0.973）。以抗壞血酸的吸光值1.0為參考量，根據以上公式計算可得：1 g白僵蠶65%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當于65.76 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶80%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當于66.29 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶95%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當于30.97 mg抗壞血酸。結果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物均具有較強的還原能力，其總還原力為白僵蠶80%乙醇提取物＞白僵蠶65%乙醇提取物＞白僵蠶95%乙醇提取物。

3 討論

DPPH含有3個共振苯環，是一種較為穩定且難以清除的自由基，它的單電子在517 nm處有較強吸收峰。DPPH自由基的乙醇溶液呈紫色，與抗氧化劑反應后，其單電子將接受一個電子或者與氫原子配對而形成穩定的DPPH-H化合物，使乙醇溶液從原本的紫色轉化為黃色［20］。DPPH憑借這一高靈敏特性，常被用于定量檢測樣品的抗氧化性。羥基自由基（·OH）是最強大的活性氧化物之一，本身攜帶未配對電子，可通過無選擇性地搶奪其他分子的電子來產生一系列的自由基反應，能夠清除羥基自由基，是抗氧化劑抗氧化力強的有效證明。因此，羥基自由基也常被用于抗氧化試驗［21］。高價鐵離子是為大家所熟知的氧化劑，二價鐵離子在空氣中暴露一段時間就會轉化為三價鐵離子，由此采用鐵氰化鉀法可測定抗氧化劑的總還原能力［19］。

圖3 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的還原能力Fig 3 Reduction Ability of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations ethanol

本試驗通過提取制備白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物，并分別檢測其對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性以及還原能力，來評價白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用。研究結果顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物均具有較好的DPPH自由基清除活性、羥基自由基清除活性和還原能力，其清除率、吸光度與提取物濃度均呈現出良好的量效關系，表現出良好的體外抗氧化作用。在65%、80%、95%三個乙醇提取濃度中，白僵蠶80%乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力最強，其IC50值為3.916 μg/mL；白僵蠶80%乙醇提取物的還原能力也最強，其AEAC值為66.29 mgVC/g；白僵蠶65%乙醇提取物對羥基自由基的清除能力最強，其AEAC值為162.43 mgVC/g。綜合來看，白僵蠶80%乙醇提取物的體外抗氧化作用更好。

蔣學采用CCD響應面方法，初步確認了80%乙醇是提取白僵蠶中黃酮類和多糖類化合物的最佳提取溶劑濃度［6］。本研究發現，白僵蠶80%乙醇提取物具有更優的體外抗氧化活性，與蔣學研究結果相一致。本研究結果為建立白僵蠶抗氧化成分提取的最佳技術工藝提供理論依據，也促進了白僵蠶抗氧化相關產品的開發。