骨髓間充質干細胞治療骨科疾病的研究進展

楊國清，梁文強，張懷斌，王勇平

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730030； 2.蘭州大學第一醫院骨科，蘭州 730030)

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)起源于中胚層，單個細胞呈紡錘狀，具有多向分化潛能，在不同條件下能誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等[1]。BMSC成骨分化由多種細胞因子、蛋白等調控，但其調控過程復雜，受多種信號通路的影響，且各通路之間并不完全獨立。目前各信號通路的確切機制尚未明確，進一步明確通路的機制、作用及各通路間的相互關系對BMSC在臨床中的應用具有重要意義。BMSC具有取材方便，增殖能力強，免疫原性低、易于基因轉染、分化潛能強等優點，是目前研究及臨床應用最優的干細胞。隨著研究的不斷深入及相關技術的日益成熟，BMSC廣泛用于骨科臨床疾病的治療。骨缺損、股骨頭壞死、軟骨損傷、脊髓損傷、椎間盤退變是目前臨床上常見的難治性骨科疾病，而傳統的治療方法存在諸多缺點，長期療效一般，術后并發癥較多等。BMSC在特定的誘導條件下能夠定向分化為病變部位所需要的細胞來修復損傷、壞死的組織，有望使病變部位恢復正常的生物學結構。現就BMSC在骨科疾病治療中的研究進展進行綜述。

1 BMSC概述

間充質干細胞來源廣泛，可存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血、羊水等[2]，而骨髓中的間充質干細胞較易提取，BMSC在骨髓中的含量較少，僅占骨髓單核細胞的0.001%～0.01%，且隨著年齡的增長而降低[3]。目前BMSC的分離培養方法包括全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法、免疫磁珠法等[4]。這些方法各有優缺點，目前最常用的為全骨髓貼壁法、密度梯度離心法，這兩種方法操作簡單、分離的細胞活性好、增殖能力強。隨著人們對BMSC表面抗原認識的深入，有學者采用流式細胞儀分選法、免疫磁珠法對BMSC進行分離提純，雖然這兩種方法分離得到的BMSC純度較全骨髓貼壁法和密度梯度離心法更高，但對細胞的損傷較大、細胞增殖緩慢[5]，且價格昂貴，操作難度大，并未作為首選。2006年國際細胞治療協會提出了定義人類間充質干細胞的最低標準[6]：①在標準培養條件下，間充質干細胞必須保持塑料黏附性；②間充質干細胞必須表達CD105、CD73和CD90，而不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、人類白細胞抗原-DR；③間充質干細胞在體外具有多向分化潛能。目前BMSC的特異性表面標志物仍未發現。BMSC的鑒定是目前研究的難點，尚無統一標準，最常用的是倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化，并聯合流式細胞儀和免疫熒光染色法檢測細胞表面標志物的鑒定方法。

2 BMSC在骨科疾病中的應用

近年來，以BMSC為基礎的國內外研究在治療骨缺損、股骨頭壞死、軟骨損傷、脊髓損傷、椎間盤退變等方面均取得一定的研究進展

2.1骨缺損 骨缺損是目前骨科一種嚴重的難治性疾病，臨床上骨缺損主要由嚴重的創傷、感染、腫瘤切除、先天性畸形等引起。目前治療骨缺損的方法主要有骨移植技術、IIizarov骨搬運技術、髓內釘系統骨延長技術、Masquelet誘導膜技術、鈦網cage技術和組織工程技術等[7]，但上述技術存在治療范圍局限、操作難度高、治療效果及預后不理想等缺點。目前運用BMSC治療骨缺損的方法包括BMSC植入骨缺損處、BMSC聯合骨植入、BMSC復合生物支架材料植入等，其中BMSC復合支架材料治療骨缺損是研究的主要方向。

基礎研究階段僅是BMSC和支架材料單純聯合應用，但近年的研究是在此基礎上加入誘導劑、調控因子、蛋白以及運用基因工程技術等，如骨形態發生蛋白及相關基因、細胞因子、某些中西藥成分、非編碼RNA等。

陶瓷生物材料通常是由磷酸鈣組成，其具有生物相容性、骨傳導性以及抗壓縮和抗腐蝕的優點，常見的基于磷酸鈣的支架有羥基磷灰石、β-磷酸三鈣及其組合，即雙相磷酸鈣。Maiti等[8]研究發現，將人重組骨形態發生蛋白2添加到接種了兔BMSC的二氧化硅涂層的羥基磷灰石支架中，可促進兔大節段骨缺損(30 mm)愈合。賈丙申等[9]實驗結果表明，淫羊藿苷干預下BMSC與磷酸鈣骨水泥復合體能盡快地恢復股骨生物力學性能，且淫羊藿苷干預能加快磷酸鈣骨水泥的降解及促進新生骨形成，從而有效修復股骨缺損。聚合物生物材料的來源有天然和人工合成兩類，各有優缺點，天然聚合物與天然骨質的結構和生化特性更貼近，但缺點是熱穩定性、骨傳導性及對其降解控制不佳。天然生物材料包括膠原、明膠和殼聚糖等，DeKok等[10]研究發現人BMSC復合膠原蛋白修復大鼠顱骨缺損模型能明顯促進骨缺損修復。合成聚合生物材料支架的理化性質通常較佳，如機械性能好、骨傳導性強、生物相容性和可降解性優良，常用的材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羥基乙酸、聚己內酯等。Harada等[11]先將BMSC體外分化為軟骨細胞，再將植入了上述軟骨細胞的聚乳酸-羥基乙酸支架植入大鼠骨缺損模型，能夠有效治愈大鼠的臨界(5 mm)和巨大(15 mm)股骨缺損。因此，將陶瓷和聚合生物材料復合成高性能的復合生物材料是未來的研究方向。

3D打印生物支架材料是目前研究的熱點。Yan等[12]制作了3D打印的可降解生物支架，該支架可通過表面氨解和逐層組裝技術控制去氧胺的釋放，在大鼠大骨缺損模型中，該支架可促進血管再生及缺損部位的骨再生。Wang等[13]研究顯示，仿生的3D聚(ε-己內酯)/羥基磷灰石/膠原蛋白支架對BMSC具有較好的骨誘導和骨再生能力。

2.2股骨頭壞死 股骨頭因解剖結構極易發生壞死，根據病因不同可分為創傷性和非創傷性股骨頭壞死，創傷性股骨頭壞死的主要病因包括股骨頸骨折、髖關節脫位、髖臼骨折等，非創傷性股骨頭壞死的病因包括過量使用糖皮質激素、過度飲酒、器官移植、減壓病、鏈狀細胞貧血、自身免疫性疾病等[14]。股骨頭壞死是一種病理過程，主要是因為股骨頭血液供應嚴重減少和骨內壓力增加，導致骨髓細胞及骨細胞死亡，通常壞死段股骨頭塌陷[15]。傳統治療早期股骨頭壞死的方法(包括藥物治療、物理治療、骨瓣移植術、髓芯減壓、截骨術、鉭棒植入術等[16])在發病早中期能夠延緩病情進展，提高患者生活質量，但基本難以避免病情發展至晚期，最終行人工髖關節置換術。由于人工髖關節使用壽命的限制，青中年患者均不可避免地進行二次手術。有研究發現，激素/酒精引起的非創傷性股骨頭壞死的機制可能是股骨干骺端附近的BMSC數量減少及活性降低，股骨頭成骨能力降低，不能有效地修復股骨頭[17]，而且股骨頭壞死患者壞死區域骨細胞和成骨細胞凋亡增加[18]。BMSC不僅能夠成骨分化，還能為細胞提供適宜的微環境。目前，運用BMSC治療股骨頭壞死的方法有BMSC移植、BMSC聯合其他方法、BMSC的組織工程技術等。Yuan等[19]納入了7項病例對照試驗評估自體BMSC植入治療股骨頭壞死的療效，Meta分析結果顯示，BMSC植入可提高股骨頭壞死的臨床療效，延遲股骨頭壞死進展，降低髖關節置換術發生率并改善Harris髖關節評分。Tabatabaee等[20]將28例早期股骨頭壞死患者隨機分為兩組：A組采用髓芯減壓聯合股骨頭內注射含BMSC的濃縮自體骨髓，B組采用單純髓芯減壓，結果顯示，與B組相比，A組Harris髖關節評分和疼痛評分均明顯改善，磁共振成像顯示A組股骨頭壞死顯著改善，B組則有明顯惡化。Kang等[21]回顧性分析了髓芯減壓單獨治療和髓芯減壓+BMSC植入治療股骨頭壞死患者的臨床資料，平均隨訪4年，結果表明，在股骨頭壞死早期將BMSC植入股骨頭可降低髖關節置術的發生率，但股骨頭壞死國際分期進展不受影響。Zhao等[22]利用BMSC與多孔鉭棒植入結合血管化骨移植治療24例(31髖)股骨頭壞死晚期患者，隨訪26～78個月，平均(64.35±13.03)個月，僅有5例患者發展至行人工髖關節置換術，所有患者的Harris髖關節評分顯著提高，表明BMSC可有效延遲或避免晚期股骨頭壞死患者全髖關節置換。Zhang等[23]研究表明，成纖維細胞生長因子2基因過表達慢病毒轉染BMSC結合異種脫抗原松質骨構建組織工程骨可有效促進血管再生，提高股骨頭缺血性壞死的修復效果。股骨頭壞死治療的關鍵是早診斷、早治療，隨著細胞、基因工程、組織工程、生物材料等技術的不斷發展，未來BMSC用于股骨頭壞死的技術將更加完善成熟，有望治愈股骨頭壞死。

2.3軟骨損傷 外傷、病變及老年退行性改變均可能造成軟骨損傷，引起關節炎，然而軟骨的自我修復能力差，傳統的治療方法效果不理想，不能恢復損傷的軟骨。隨著再生醫學的發展，軟骨的再生在軟骨損傷治療中越來越重要。間充質干細胞不僅能分化為軟骨細胞，還具有免疫調節活性，能夠防治軟骨細胞凋亡，這是間充質干細胞治療軟骨損傷的分子機制[24]。目前BMSC治療關節炎的方法主要有BMSC直接關節腔內注射、可吸收支架負載BMSC植入。Chahal等[25]對晚期膝關節骨性關節炎患者關節腔內注射不同濃度自體BMSC，結果顯示患者的膝關節被動關節活動度及西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數均改善，且隨著BMSC濃度的增加，軟骨保護作用逐漸增強，而滑膜炎評分逐漸降低。Davatchi等[26]將(8.0～9.0)×106個BMSC注入4例骨性關節炎患者關節腔內，6個月時患者日常活動的難易程度、疼痛、膝關節活動度均得到改善，其中3例隨訪5年，患者病情雖逐漸加重，但仍優于治療前。單純的BMSC注射操作簡單，無需手術，但細胞的存活、利用率低，僅有少數細胞存留在受損部位，而將BMSC負載到支架上能有效解決這一問題。Wang等[27]通過模擬成熟關節軟骨的結構、化學及力學特性，制備了雙層仿生軟骨支架，支架表面層由膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸鈉制成，用膠原蛋白、殼聚糖和絲素蛋白制備具有微管陣列結構的過渡層，將負載BMSC的支架植入兔膝骨關節炎軟骨缺損模型中，結果表明仿生軟骨支架可以誘導BMSC的增殖和分化，并有效修復兔膝骨關節炎軟骨缺損。Gobbi和Whyte[28]對50例Ⅳ級膝關節軟骨損傷患者進行微骨折手術或使用人BMSC復合透明質酸支架治療，隨訪5年，結果顯示，支架組軟骨修復效果更好且更持久。由于軟骨的再生能力差，軟骨的損傷修復還面臨巨大挑戰。BMSC復合支架材料修復軟骨損傷的研究大多處于動物實驗階段，仍需要大量的研究進行完善。

2.4脊髓損傷 脊髓由于結構特殊，一旦損傷，恢復極其困難，目前尚無確切有效的治療手段。BMSC在不同的條件誘導下可以分化為不同亞型的神經元和膠質細胞，因此BMSC可作為治療脊髓損傷理想的備選細胞，目前研究發現BMSC能在損傷區域發揮免疫調節、抗炎及抑制淋巴細胞增殖和分化的作用，此外BMSC能在損傷區促使巨噬細胞由M1型向M2型轉變，還能釋放大量營養因子保護受損脊髓組織以及具有誘導血管再生的功能[29]，這均有助于脊髓的修復。由于單純的BMSC治療脊髓損傷的效果不理想，大多數研究采用BMSC聯合其他方法，如BMSC聯合基因工程技術、藥物、其他細胞和細胞因子、組織工程技術，且大部分研究因安全性、療效、預后等不確定性仍處于動物實驗階段。Jia等[30]研究表明，Shh基因轉染的BMSC能夠促進大鼠脊髓損傷后神經功能的恢復。Kumagai等[31]研究顯示，表達不同神經營養因子基因的BMSC可以促進軸突再生，防止脊髓損傷后超敏反應及促進血管生成并改變瘢痕形成，從而有效促進脊髓損傷后的細胞生長和感覺功能的改善。Okuda等[32]研究表明，抗壞血酸誘導的BMSC植入脊髓損傷大鼠模型中可通過抑制神經膠質瘢痕的形成促進軸突再生，從而有效治療脊髓損傷，且無需支架即可進行自體移植。Günther等[33]將表達腦源性神經營養因子的BMSC復合藻酸鹽水凝膠支架植入半橫斷大鼠脊髓損傷模型中,結果顯示與不植入水凝膠支架組相比，有支架負載的表達腦源性神經營養因子的BMSC組再生軸突增加3～4倍，軸突的方向與水凝膠通道平行，不植入支架組軸突生長方向呈隨機生長。

2.5椎間盤退行性變 隨著年齡的增長，椎間盤組織出現退變，髓核細胞數量減少，且活性降低，椎間盤中水分、Ⅱ型膠原和蛋白多糖等物質含量減少，加之長期外力的刺激，導致加速椎間盤退變，椎間隙高度逐漸丟失。椎間盤退行性變能夠引起一系列癥狀，腰痛是最常見的癥狀，椎間盤退行性變被認為是下腰痛的主要原因之一[34]。傳統的手術方式有脊柱融合、微創手術，但脊柱融合手術創傷較大，可導致脊柱的活動度降低，而椎間孔鏡髓核摘除可改變椎間盤正常的結構，且傳統的治療方式復發率高，可引起相鄰階段的椎間盤病變。近年來，BMSC在再生醫學的應用為椎間盤退變的治療提供了新方向。Freeman等[35]將同種異體BMSC注射到綿羊模型的纖維環或髓核中，后、外側環自發修復，椎間盤狀況顯著改善。Zhang等[36]將同種異體BMSC懸浮于水凝膠中移植到椎間盤退變山羊模型體內，與注射0.9%氯化鈉溶液或水凝膠相比，6個月后髓核區域蛋白聚糖含量明顯增加。近年來，在臨床試驗方面也進行了多項研究，Centeno等[37]將體外培養的自體BMSC注射入椎間盤退變患者椎間盤內，經過6年隨訪，結果顯示大部分患者疼痛癥狀明顯減輕，椎間盤功能增強，椎間盤膨出減少，安全性良好。Pettine等[38]將自體骨髓濃縮液注射到椎間盤源性下腰痛患者椎間盤內，結果顯示，2年內疼痛持續緩解(視覺模擬評分減少71%)，Oswesty功能障礙指數評分明顯改善(>64%)。Cheng等[39]研究顯示，BMSC可以通過外泌體傳遞外源性miR-21來激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路抑制髓核細胞凋亡，從而減緩椎間盤退變。雖然已有大量的試驗證明BMSC能夠治療椎間盤退變，但確切的作用機制仍不明確，其安全性仍需要大量的試驗進行評估。

3 小 結

BMSC在骨科多種難治性疾病治療中是理想的種子細胞，特別是BMSC與各種支架材料聯合是目前研究的熱點，其在多種疾病的治療中也取得一定進展。但對于BMSC的研究仍有許多難點尚未突破，如BMSC的特異性表面標志物，BMSC向不同細胞定向分化的分子機制，不同的支架材料對BMSC增殖分化的影響以及具體機制，所制備支架材料的理化性質能夠達到治療所需的要求，同時許多研究還處于體外或動物實驗階段等。相信隨著研究的深入，BMSC在各種疾病治療中的應用將會取得突破性進展。