HIV儲存庫形成及檢測方法的研究現狀

王雪，陳曉紅

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院感染科，哈爾濱 150001)

人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus，HIV)是一種雙鏈RNA逆轉錄病毒，變異非常活躍。HIV-1主要選擇性地侵入人體免疫系統的CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，拷貝插入宿主細胞DNA中的HIV形成前病毒，即HIV儲存庫[1]。感染細胞以前病毒為模板，通過轉錄、剪切、翻譯等借助宿主細胞內物質產生更多HIV顆粒[2]，創造新的感染周期，傳播受感染的細胞，從而導致HIV的惡性傳播。一般情況下，人體感染HIV后，如果不經抗病毒治療，8～10年即可進展至艾滋病期，因此早發現、早治療顯得尤為重要。高效抗反轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出現為獲得性免疫缺陷綜合征的治療提供了新途徑，但目前的治療方法并不能徹底清除HIV儲存庫。因此，研發可清除宿主細胞DNA中攜帶整合、可復制的HIV儲存庫的策略迫在眉睫。HIV儲存庫對HAART和宿主免疫系統的清除具有抗藥性，抗病毒治療一旦停止，就會導致病毒反彈，引起新一輪的感染[3]。現就HIV儲存庫形成及檢測方法的研究現狀予以綜述。

1 HIV儲存庫的形成

1.1HIV儲存庫潛伏期的機制 關于HIV儲存庫潛伏期的機制目前探討最多的為整合前潛伏和整合后潛伏。整合前潛伏是指HIV以雙鏈DNA的形式存在于靜息CD4+T細胞胞質內，當外界抗原進入機體活化靜息CD4+T細胞時，HIV就整合進入宿主遺傳物質開始復制周期；整合后潛伏是指HIV的雙鏈DNA先整合到宿主遺傳物質中，以前病毒的形式維持病毒庫的穩定[4]，其中整合后潛伏占主導要地位。

1.1.1表觀遺傳 表觀遺傳可調控細胞染色質，HIV DNA的整合位置主要是細胞染色質，因此HIV DNA的表達受相同表觀遺傳機制的調控。有研究證明，當DNA甲基化位于啟動子時，可以導致體外潛伏期模型中的HIV原病毒表達沉默，這也是常見的與轉錄抑制相關的表觀遺傳機制[5]。因此，可通過DNA甲基化維持HIV潛伏期。Hughes等[6]研究發現，約70%的脊椎動物基因啟動子與CpG島的DNA元素相關，而CpG島對DNA甲基化不敏感。CpG島可以影響染色質調節因子的活性，這些調節因子可以翻譯后修飾組蛋白并調節基因表達。另一方面，組蛋白乙酰化通常與活躍的轉錄相關[7]。用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A治療HIV潛伏感染細胞，可以激活病毒，表明組蛋白去乙酰化在維持潛伏期中起主要作用[8]。

1.1.2位點選擇 前病毒對于宿主DNA位點的選擇存在特異性。對前病毒整合位點的進一步分析表明，HIV-1更傾向于主動轉錄的基因[9]。Singh等[9]對從培養的HEK293T細胞中分離的100萬個HIV-1整合位點進行測序分析后發現，內含子和選擇性剪接均有助于整合位點的選擇。事實上，HIV-1整合酶通過與細胞剪接相互作用，在選擇整合位點方面起關鍵作用。HIV-1整合酶可直接與晶狀體上皮源性生長因子/p75相互作用，通過將整合前復合體與染色質結合促進HIV整合[10]。晶狀體上皮源性生長因子/p75常與許多剪接因子相互作用，并通過這些剪接因子將HIV-1整合到高度剪接的轉錄單元上。由此可見，HIV-1通過選擇主動轉錄的基因進行整合來避免潛伏期。

1.1.3轉錄干擾 整合是HIV復制中關鍵且不可逆的環節，盡管有抑制性抗反轉錄病毒治療，但HIV在長壽命細胞庫中仍持久存在，即潛在的前病毒常在高表達基因中整合，表明高表達基因的轉錄可干擾病毒的轉錄[11]。Lenasi等[12]研究證明，宿主基因在轉錄時會抑制整合在基因中的前病毒的表達。當前病毒DNA的極性與宿主基因的極性相同時，啟動子就會被阻斷，在這種情況下，通過延長RNA聚合酶Ⅱ的轉錄可干擾HIV-1轉錄所必需的轉錄因子的組裝，而轉錄起始復合物的缺乏會導致HIV-1潛伏期[13]。因此，在病毒潛伏期，HIV-1可以通過抑制上游轉錄或協同激活病毒轉錄起始和延伸來抵消轉錄；然而，當前病毒DNA與宿主基因具有相反的極性時，RNA聚合酶Ⅱ可能發生碰撞，導致病毒轉錄提前終止[14]。

1.1.4病毒蛋白與HIV-1再激活 HIV感染細胞的潛伏期受兩種HIV-1蛋白(即Tat和Vpr)的調節。Tat是轉錄的反式激活因子，也是編碼于HIV基因組中的一種關鍵調節蛋白，受單個HIV啟動子控制。Cao等[15]通過研究HIV感染細胞的潛伏機制和反式激活細胞表型發現，增加Tat乙酰化可顯著增加Tat和病毒的產生，而增加Tat反式激活可更快地反式激活潛伏細胞。作為病毒反式激活因子的調節蛋白，Tat的缺失是HIV-1潛伏期的一個關鍵因素[16]。而HIV-1輔助蛋白Vpr則可再一次激活潛伏感染的細胞。對HIV-1感染患者進行血清學檢查發現，患者外周血中Vpr的數量顯著高于Tat，因此細胞外Vpr在激活HIV-1潛伏感染細胞中占據重要地位[17]。Rev也是一種調節蛋白，可結合HIV的信使RNA，促進病毒中信使MRA的核質轉運，且需要多個Rev單體結合Rev反應元件將病毒信使RNA轉運至細胞質，因此Rev表達水平與功能間的關系是非線性的[18]；同時，還需要一定水平的Rev維持病毒蛋白的活性表達，Rev表達不足則可能導致HIV-1潛伏期[19]。

1.2HIV儲存庫的存在部位 HIV DNA儲存庫存在于外周血的多種細胞中，主要包括單核細胞和中心記憶CD4+T細胞、過渡狀態的記憶CD4+T細胞以及效應記憶CD4+T細胞等。

1.2.1淋巴結 淋巴結是主要的HIV儲存庫,高水平激活和高水平復制的特點可以快速誘發其感染新的細胞。因此，淋巴結在HIV儲存庫的動態變化中起重要作用。Fukazawa等[20]通過研究恒河猴胚胎干細胞模型發現，濾泡輔助性CD4+T細胞多在分化過程中被感染，且不易被特異性免疫反應或抗反轉錄病毒藥物所獲取。可見，淋巴結是HIV儲存庫清除的一個障礙。Lorenzo-Redondo等[21]研究證實，在HIV感染者行HAART過程中，淋巴組織中的HIV發生了變化，表明HIV儲存庫存在進行性復制。但當HAART中斷時，會出現許多表達不同病毒RNA的變異細胞，有助于HIV的反彈[22]。

1.2.2內臟相關淋巴組織 對人類和猿類模型的研究顯示，內臟相關淋巴組織包含人體60%的淋巴細胞，內臟相關淋巴組織通過輔助性T細胞17耗竭、細菌易位和局部宿主細胞激活等方式促進HIV復制，導致HIV在細胞感染中持續存在[23-25]。在急性和早期HIV感染期間，胃腸道CD4+T細胞的HIV DNA載量較血液中CD4+T細胞的HIV DNA載量平均高13倍[26]。非CD4+T細胞在腸道中攜帶的HIV DNA較CD4+T細胞攜帶的HIV DNA少，但內臟相關淋巴組織中非CD4+T細胞的感染水平高于血液[27]。在內臟相關淋巴組織中，髓細胞也含有HIV DNA[28]。在HAART啟動后，內臟相關淋巴組織中的HIV DNA載量降低但不會消失[29]，且HIV DNA載量在不同的腸道位置存在差異[30]。在回腸和直腸細胞中，記憶效應CD4+T細胞中含有的HIV DNA最多[31]。與未接受HAART的患者相比，接受HAART患者直腸中的HIV DNA載量升高[32]。可見，內臟相關淋巴組織中的總HIV DNA與感染不同階段血液中的總HIV DNA載量相關。

1.2.3其他組織 中樞神經系統在單核細胞將感染由外周轉移至大腦的過程中具有特殊作用[33]。單核細胞可遷移到各種組織并分化為抗原呈遞細胞，如巨噬細胞、膠質細胞和樹突狀細胞等。膠質細胞是大腦中HIV-1的主要靶點，在中樞神經系統中可以作為HIV儲存庫發揮作用[34]。另外，由于血腦屏障的存在，大部分抗病毒藥物難以透過血腦屏障進入大腦，因此血腦屏障也成為HIV的天然保護層，增加了病毒耐藥突變的發生率[35]；其次，腦內潛伏的HIV較少與外周細胞或組織進行遺傳物質交換[36]。由于HAART僅可起到局部抑制作用，且目前的抗病毒藥物對腦內的病毒無效，因此含有HIV DNA的細胞一直存在[37]。另外，脂肪組織中的記憶CD4+T淋巴細胞也是一個潛在、重要的HIV儲存庫，在未經治療的獼猴和接受有效治療的HIV感染者中均檢測到HIV DNA[38]。未來，測量不同組織和液體中的總HIV DNA，有助于評估針對清除HIV儲存庫的治療策略。

1.3HIV DNA在病毒復制中的主要存在形式 在HIV儲存庫中，非整合的前病毒占比為10∶1～100∶1，主要包括線性非整合DNA和環狀非整合DNA[39]。其中，環狀非整合DNA包括1個長末端重復序列 (long terminal repeat，LTR)和含有2個LTR的環狀HIV DNA。線性非整合DNA和環狀非整合DNA在分子結構、穩定性、表達特性以及在潛伏期中的作用等方面均存在差異。線性非整合DNA結構不穩定，很容易降解，因此其臨床意義較小[40-41]；2-LTR HIV DNA的結構較特殊，因此與線性非整合HIV DNA相比，2-LTR HIV DNA的臨床意義更大[42]。非整合形式前病毒主要存在于感染細胞內，參與HIV致病機制的形成。而整合的前病毒大部分因高突變、缺失以及轉錄后沉默造成缺陷不能形成病毒復制，這些缺陷前病毒的作用可能與非整合前病毒作用一致。在HIV持續復制中真正起作用的前病毒所占比例較小，非缺陷的整合前病毒是最穩定的形式[43]，可導致潛伏性感染或有轉錄活性的感染；同時非缺陷的整合前病毒也是HIV儲存庫的基本成分，是病毒清除的主要障礙[44]。

2 HIV DNA的檢測方法及意義

2.1HIV DNA的檢測方法 HIV儲存庫的檢測方法主要包括以細胞培養為前提的病毒外生測定法以及基于DNA儲存庫核酸結構的定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測法。而關于DNA儲存庫的臨床研究主要應用熒光定量PCR檢測法。

2.1.1Alu-gag PCR Alu-gag PCR是檢測感染細胞中整合前病毒的一種定量分析方法[45]。該方法主要通過兩個步驟實時PCR檢測：①用與Alu、gag序列匹配的引物擴增gag與最近的Alu之間的區域[46]；②通過巢式PCR擴增識別第一步驟中特異性擴增產物中長末端重復序列的R-U5區域[45]。Alu-gag PCR檢測精確且靈敏度高，對整合前病毒的量化十分靈敏。Alu-gag PCR檢測的弊端在于不能辨別缺陷病毒與非缺陷病毒，導致實際測出的HIV儲存庫遠高于理論數值。

2.1.2定量病毒生長檢測法(quantitative viral outgrowth assay，Q-VOA) Q-VOA可以檢測出有復制能力的前病毒的數量[45]。傳統的Q-VOA以健康供者的CD4+T淋巴細胞為目標，其病毒復制率低，且耗時長、成本高、程序復雜；最新的Q-VOA則以CC趨化因子受體5和CXC趨化因子受體4共受體的人急性淋巴母細胞白血病細胞/CC趨化因子受體5體外細胞株為目標，其克服了病毒復制率低、耗時長、成本高等缺點[45,47]，因此目前廣泛應用于臨床。但最新的Q-VOA也存在弊端：①其僅能檢測HIV生命周期的一個組成部分，無法完整檢測組織中的病毒庫，導致實際測出的HIV儲存庫遠高于理論數值；②檢測的血樣本量較小，準確檢測的血樣本量應>150 mL[45]；③檢測耗時長且成本高，患者難以接受。

2.1.3Tat/Rev誘導的限制稀釋法 Tat/Rev誘導的限制稀釋法是一種基于PCR的分析方法，可重復、敏感地測量臨床樣本中有效和潛在的感染HIV的CD4+T細胞的頻率[48]。這些有效和潛在的感染HIV的CD4+T細胞主動產生編碼Tat/Rev蛋白的多重剪接RNA，因為多重剪接RNA在潛在感染細胞中不存在，但在病毒重新激活后可被誘導[48]。雖然Tat/Rev誘導的限制稀釋法需要較小的血樣量，不需要提取病毒核酸，但仍會導致實際測出的HIV儲存庫數量遠高于理論數值[45]。

2.2HIV DNA定量檢測的意義

2.2.1在早期篩查方面的意義 HIV DNA作為HIV儲存庫標志物，其最主要的優勢為窗口期最短，即在感染HIV后3～7 d就可建立HIV儲存庫，因此將其應用于HIV早期篩查可準確揭示病毒感染程度、患者病情進展及臨床分期。在國內，HIV DNA定量檢測技術還具有價格相對較低且穩定性高等優勢，同時需要的血液量少、所受干擾少、特異性高，因此可用于嬰幼兒HIV感染的診斷。HIV DNA可以在血液和其他體液中被檢測到，HIV DNA定量檢測技術是組織活檢標本中應用最廣泛的量化HIV儲存庫的方法[49]。在大多數情況下，血清學檢測在區分 18個月以下嬰兒HIV抗體來源方面缺乏足夠的敏感性和特異性，因此HIV DNA檢測有助于確認特異性抗體產生不足時的HIV感染[50]。采集嬰兒血樣標本時應注意：①要具備小嬰兒靜脈穿刺所需的專業知識；②在2～25 ℃下運輸和儲存血樣標本；③在獲得血樣后4 d內進行檢測。

2.2.2在病情預測方面的意義 HIV DNA定量檢測具有簡單、標準化、靈敏和可重復的特點。在臨床上，HIV DNA載量可以反映HIV感染的過程，特別是，HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進展和死亡的預測因子，獨立于HIV RNA和CD4+T細胞計數之外。基線總HIV DNA載量可預測HAART，HIV DNA載量在HAART期間降低但仍可量化，其水平既可反映感染史(HIV RNA峰值、CD4+T細胞計數的最低點)，也可反映療效(殘余病毒血癥、累積病毒血癥、免疫恢復、免疫細胞活化)[51]。血液中總的HIV DNA載量還可預測某些HIV-1相關終末器官疾病的存在和嚴重程度。雖然HIV DNA不能區分復制能力強的和有缺陷的潛伏病毒，但血液、組織和細胞中的總HIV DNA載量可從某種程度上反映HIV的發病機制，這可能由于所有的病毒形式均參與了宿主細胞的激活和HIV的發病過程。HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進展和死亡的預測因子，HIV DNA載量高的患者病程進展快、免疫功能差、并發癥嚴重且合并感染及病死率均更高[51]。

3 小 結

雖然經HAART后HIV感染者的壽命延長，但長期服藥的依從性不良、耐藥性、不能徹底根除HIV仍是HIV感染者潛在的致命威脅。徹底治愈HIV感染者，HIV儲存庫仍是研究重點。首先應明確HIV潛伏感染的機制，找到準確且敏感的測量方法以量化HIV儲存庫的大小。雖然研究者嘗試多種方法清除體內整合的HIV，且取得了一定進展，但要應用于臨床還需更深入的研究。HIV DNA作為HIV儲存庫的標志物具有臨床相關性，可在臨床實踐中廣泛應用。將HIV DNA用于監測HAART的效果，或許可為減少或清除HIV策略的研究提供新思路。