巨噬細胞在骨骼肌損傷再生中的研究進展

程建紅，洪莉，洪莎莎，湯劍明

(武漢大學人民醫院婦產科，武漢 430060)

骨骼肌損傷最常見于交通事故和運動損傷中，骨骼肌是機體最具再生能力的組織之一，在骨骼肌受到損傷(牽拉、撕裂、鈍挫等)后數月，其形態和功能可在一定程度上恢復至正常。骨骼肌驚人的再生能力主要依賴于骨骼肌干細胞，即肌衛星細胞的修復能力[1]。骨骼肌受到損傷時，處于靜止狀態的肌衛星細胞激活并增殖形成成肌細胞，成肌細胞相互融合分化為多核肌管，肌管新生或與幸存的組織相互融合形成肌纖維，完成骨骼肌損傷后的再生過程。骨骼肌受到損傷立即觸發高度協調的再生過程，構成由免疫細胞、炎癥細胞以及調節肌衛星細胞增殖和分化的細胞因子等組成的復雜交織的“衛星細胞龕”。可見，骨骼肌損傷后的再生過程需要不同細胞群之間的協調作用[2]，其中巨噬細胞在骨骼肌損傷再生過程中發揮不可或缺的作用，是骨骼肌損傷再生中不同生物學過程的關鍵調節者，參與炎癥、骨骼肌再生、組織重構和血管生成等過程[3-6]。骨骼肌損傷性疾病一直是全球主要的公共衛生問題，缺乏真正有效的治療策略，骨骼肌損傷后的再生研究領域受到廣大科研工作者的廣泛關注?，F對骨骼肌損傷再生過程中巨噬細胞的潛在功能以及巨噬細胞與其他細胞間的相互作用予以綜述，以期為骨骼肌損傷后再生過程以及骨骼肌損傷性疾病的研究和治療提供參考。

1 骨骼肌中巨噬細胞的概述

1.1骨骼肌損傷再生中巨噬細胞的來源 巨噬細胞參與骨骼肌損傷后的再生過程，其來源主要有兩種，一種是長期存在于骨骼肌中的固有巨噬細胞，終生靜息存留在健康骨骼肌內，在骨骼肌發生病損時發揮作用[7]；另一種是骨骼肌損傷后來源于骨髓的浸潤巨噬細胞，在骨骼肌病變時侵入骨骼肌。骨骼肌固有巨噬細胞源自胚胎期的卵黃囊，成年后定植于骨骼肌中，可通過原位增殖進行自我更新補充[8]。從外周循環招募的浸潤巨噬細胞由造血干細胞經由單核細胞分化形成。與浸潤巨噬細胞不同，骨骼肌固有巨噬細胞不具有吞噬能力[9]。骨骼肌固有巨噬細胞被認為是一種“哨兵”，容易被骨骼肌損傷時分泌的損傷相關分子模式激活，具有促進其他炎癥細胞募集的功能。目前，盡管固有巨噬細胞的起源和組織特異性功能已在許多其他組織中得到廣泛研究，但它們在骨骼肌中的特征尚不明確，其在骨骼肌損傷再生中的潛在作用需要進一步研究。

1.2骨骼肌損傷部位巨噬細胞的募集及對炎癥反應的調節 巨噬細胞是骨髓和外周淋巴組織中的主要髓系細胞，在骨骼肌損傷后炎癥初期，從外周循環募集至損傷部位成為骨骼肌中的炎癥性巨噬細胞。首先，源自骨髓活化的單核細胞黏附在血管內壁上，滾動并遷移至損傷部位，在損傷部位進一步分化發育成巨噬細胞。單核細胞根據不同的滲出機制和Ly6C蛋白表達水平，可分化成兩種不同功能狀態的巨噬細胞亞群，即Ly6Chi巨噬細胞亞群和Ly6Clo巨噬細胞亞群[10-11]。通過CC趨化因子受體2招募的Ly6Chi巨噬細胞在炎癥早期率先募集，表現為促炎特性。而依賴于CX3C趨化因子受體1招募的Ly6Clo巨噬細胞則較晚出現，表現出抗炎特性。

骨骼肌損傷后24 h內，外周循環中的Ly6Chi巨噬細胞侵入骨骼肌損傷部位，其數量顯著增加，并持續增加至傷后2 d。骨骼肌損傷后第2天開始，Ly6Chi巨噬細胞數量開始減少，Ly6Clo巨噬細胞開始聚集，隨后幾乎所有的LyC6hi巨噬細胞都被Ly6Clo巨噬細胞取代，Ly6Clo巨噬細胞數一般在傷后4 d時達到最高峰，并在數天內維持在較高水平[11]。Ly6Clo巨噬細胞參與骨骼肌再生的后期階段，即新肌纖維的形成和生長、組織重構、血管生成等[12]。一旦肌纖維再生結束且恢復至穩態，巨噬細胞數量降至正常水平。與此同時，巨噬細胞停止分泌促炎因子或抗炎因子，轉為一種向內穩態回歸的沉默模式[3]。Arnold等[11]發現，在骨骼肌再生的初始階段，阻斷單核細胞進入骨骼肌損傷部位可減輕炎癥反應，但同時會延遲且減少Ly6Chi巨噬細胞的募集，進而阻礙Ly6Clo巨噬細胞的正常募集和作用發揮，最終導致肌肉無效再生。由此可見，Ly6Clo和Ly6Chi巨噬細胞在骨骼肌損傷再生過程中有效和有序的募集是骨骼肌損傷后再生的關鍵，兩者缺一不可。因此，過度的抑制炎癥不利于骨骼肌的再生。

骨骼肌損傷后首先發生炎癥反應，巨噬細胞參與骨骼肌損傷后炎癥反應的全過程，即炎癥的發生、發展和消退是協調炎癥細胞聚集和發揮功能的關鍵細胞。炎癥開始時，定植于骨骼肌中的固有巨噬細胞被激活分泌中性粒細胞趨化因子1、單核細胞趨化因子1促進中性粒細胞和單核細胞的募集[6]。同時，黏附于血管內皮細胞上的巡邏單核細胞在骨骼肌損傷后1 h內迅速到達骨骼肌損傷部位，分泌大量的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，促進中性粒細胞的募集[13]，此外，巡邏單核細胞還可通過與中性粒細胞直接物理接觸延長中性粒細胞在損傷部位的停留時間，使中性粒細胞充分發揮吞噬作用，清除骨骼肌壞死組織碎片以及釋放促炎癥因子擴大炎癥反應[14]。

骨骼肌損傷后中性粒細胞在2 h內迅速到達損傷部位，數量迅速增加，傷后6～24 h達到最高峰，然后數量急劇下降。中性粒細胞到達損傷部位后通過吞噬作用釋放活性氧類、蛋白酶，刺激宿主啟動防御功能并清除病變壞死組織細胞碎片[15]。因此，在骨骼肌再生過程中，缺失中性粒細胞會導致壞死組織持續存在，進而造成骨骼肌再生延遲[16]。此外，中性粒細胞通過分泌巨噬細胞炎癥因子1和單核細胞趨化因子1刺激炎癥發展，并通過上述細胞因子招募外周循環中的單核細胞至骨骼肌受損部位[17]。隨后，Ly6hi巨噬細胞大量滲入骨骼肌受損部位，并通過分泌促炎因子[如TNF-α和白細胞介素(interleukin，IL)-6]進一步促進中性粒細胞和單核細胞的募集[17-18]，這種促炎環境在損傷后48 h左右達到高峰；此后，Ly6lo巨噬細胞成為再生骨骼肌中的主要巨噬細胞亞群抑制炎癥的發展。

骨骼肌損傷后第5天炎癥進入消退階段，炎癥消退不是由促炎信號減少引起的被動過程，而是多種細胞和細胞因子參與的主動過程[19]。Ly6lo巨噬細胞分泌大量的抗炎因子，如IL-4、IL-13，積極促進炎癥的消退。除可以減少促炎信號和活性氧類的產生外，上述細胞因子還可以阻止中性粒細胞的募集，促進中性粒細胞的凋亡以及巨噬細胞的非炎性吞噬[19]?？傊?，巨噬細胞始終在炎癥發生、發展、消退中起著核心作用。

2 巨噬細胞調控肌衛星細胞的再生能力

巨噬細胞在骨骼肌再生過程中參與調節肌衛星細胞的增殖和分化。Saclier等[20]體外實驗證實，巨噬細胞的條件培養基在體外可觸發成肌細胞增殖，在體內可促進骨骼肌再生。此外，Juhas等[21]對體外構建的3D骨骼肌模型的研究發現，巨噬細胞是組織損傷后修復所必需的，巨噬細胞具有刺激骨骼肌再生的重要作用。Arnold等[11]進一步研究發現，Ly6hi巨噬細胞通過釋放促炎細胞因子促進成肌細胞增殖，進而抑制其分化，Ly6lo巨噬細胞釋放的抗炎細胞因子抑制成肌細胞增殖而刺激其分化和融合。目前，調控肌衛星細胞功能的旁分泌因子的具體成分尚未明確，然而，巨噬細胞分泌的部分細胞因子參與了調控肌衛星細胞的功能。如Ly6hi巨噬細胞高表達的細胞因子——IL-6[22]、TNF-α[23]和前列腺素E2[24]均刺激肌衛星細胞的增殖。且Ly6hi巨噬細胞分泌的去整合素樣金屬蛋白酶可減少Notch信號通路，從而促進肌衛星細胞激活和骨骼肌再生[25]。另一方面，Ly6lo巨噬細胞高表達的IL-4[26]和胰島素樣生長因子1[27]可刺激成肌細胞分化、融合和肌纖維生長。

綜上所述，在肌肉損傷的早期階段，浸潤的Ly6hi巨噬細胞在肌衛星細胞增殖中起重要作用，而Ly6lo巨噬細胞在肌衛星細胞的分化中起重要作用。骨骼肌損傷后再生過程中，由于不同的巨噬細胞亞群對肌衛星細胞的作用不同，Ly6hi和Ly6lo巨噬細胞在時間和空間上緊密協調，在骨骼肌損傷后再生中具有重要價值。

3 巨噬細胞調節骨骼肌衛星細胞龕相關成分

骨骼肌干細胞(即肌衛星細胞)處于特殊微環境中，這種特殊微環境通常被稱為“衛星細胞龕”。除調節肌衛星細胞增殖和分化的作用外，巨噬細胞還參與衛星細胞龕相關成分的調節。其中，巨噬細胞通過調控纖維/脂肪形成祖細胞(fibro/adipogenic progenitors，FAPs)的功能調節細胞外基質的產生，通過調控內皮細胞的功能調節血管的新生，進而促進骨骼肌損傷后的修復。

3.1巨噬細胞調節骨骼肌損傷后細胞外基質重構 除肌衛星細胞外，FAPs也參與了骨骼肌損傷后的再生，并對骨骼肌再生起至關重要的作用。在骨骼肌損傷后有規律的再生過程中，FAPs細胞數量在早期(1～3 d)增加，在晚期(4～7 d)減少。損傷后FAPs的增加對于細胞外基質成分的產生至關重要，細胞外基質成分是穩定組織所必需的，可作為新纖維的支架被肌衛星細胞用作基膜，以維持肌纖維的類似排列。當骨骼肌損傷時，FAPs可促進肌衛星細胞的激活和分化，而肌衛星細胞抑制FAPs向脂肪細胞的分化[28-29]。Lemos等[5]研究證實，Ly6hi巨噬細胞通過分泌TNF-α直接刺激FAPs的凋亡來調控FAPs的聚集。此外，Cordani等[30]體外實驗發現，Ly6hi巨噬細胞分泌的一氧化氮抑制FAPs向脂肪細胞分化；而體內實驗發現，其可減少骨骼肌內脂肪和結締組織的沉積。在骨骼肌再生過程中，Ly6lo巨噬細胞可高表達轉化生長因子-β，轉化生長因子-β可阻斷TNF-α誘導的FAPs凋亡，并誘導FAPs沿纖維化譜系分化。因此，Ly6lo巨噬細胞分泌的轉化生長因子-β是FAPs在促炎反應后生存所必需的，這對骨骼肌愈合后期的組織重塑非常重要。Ploeger等[31]通過將成纖維細胞與不同亞群巨噬細胞共培養證實，Ly6lo巨噬細胞可促進成纖維細胞增殖和膠原合成，而Ly6hi巨噬細胞則通過分泌降解細胞外基質的酶，如基質金屬蛋白酶1和基質金屬蛋白酶2減少膠原合成。

在骨骼肌損傷后的再生過程中，Ly6hi巨噬細胞和Ly6lo巨噬細胞之間的平衡和時間依賴性調控能通過FAPs調節細胞外基質的合成，在肌衛星細胞增殖和分化、新生肌纖維發生、骨骼肌正常修復中發揮作用。

3.2巨噬細胞調節內皮細胞功能 骨骼肌損傷后，血管細胞與肌衛星細胞通過相互作用促進血管新生，對骨骼肌損傷后恢復非常重要。內皮細胞通過分泌多種生長因子(如胰島素樣生長因子1、肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子和血管內皮生長因子)參與調控肌衛星細胞的生長，分化后的成肌細胞可反向刺激血管生成[32]。Birbrai等[33]發現，與毛細血管內皮細胞毗鄰的周細胞亦具有刺激成肌細胞增殖的能力。

巨噬細胞具有調節血管新生的作用。Heil等[34]發現，CC趨化因子受體2缺陷小鼠中浸潤的單核細胞的缺失損害了缺血后肢動脈側支的形成，但不同亞群巨噬細胞在血管形成中的作用仍存在爭議。腫瘤相關巨噬細胞是抗炎巨噬細胞的一個獨特亞群，其具有明確的促血管生成作用[35]。然而，不同巨噬細胞亞群在非腫瘤形成環境中的作用不同。Zajac等[36]體外實驗證實，抗炎巨噬細胞促進新生血管形成的作用較促炎巨噬細胞更強。Spiller等[37]的體外模型顯示，內毒素和γ干擾素誘導刺激的促炎巨噬細胞促進血管出芽的長度和數量高于由IL-4和IL-13誘導刺激的抗炎M2a巨噬細胞，但低于由IL-10誘導刺激的抗炎M2c巨噬細胞。隨后，Latroche等[38]將內皮細胞、成肌細胞和IL-4或IL-10誘導刺激的巨噬細胞體外共培養發現，抗炎巨噬細胞可通過分泌抑瘤素M調控血管新生和骨骼肌再生。總體而言，巨噬細胞在骨骼肌損傷后血管新生的調節中起重要作用；然而，不同巨噬細胞亞群的具體作用還需進一步研究的明確。

4 小 結

骨骼肌損傷后的驚人再生能力主要依賴于骨骼肌干細胞——肌衛星細胞，肌衛星細胞是骨骼肌損傷后再生過程中發揮作用的主要細胞，但仍需要其他細胞的協同作用，特別是巨噬細胞。骨骼肌損傷時，Ly6hi巨噬細胞通過放大炎癥信號、吞噬組織碎片、產生細胞因子激活肌衛星細胞并促進其增殖。與Ly6hi巨噬細胞不同，Ly6lo巨噬細胞通過減弱炎癥反應促進成肌細胞分化、融合和骨骼肌再生。此外，巨噬細胞還參與骨骼肌干細胞龕相關成分的調節，如通過調控FAPs功能調節細胞外基質的產生，或通過調控內皮細胞的功能誘導調節骨骼肌損傷后血管新生。現已證實，巨噬細胞在損傷骨骼肌中對肌衛星細胞和“衛星細胞龕”具有調節作用,但如何更好地利用巨噬細胞對肌衛星細胞及其細胞龕進行有效調控，使其在骨骼肌損傷再生過程中發揮最佳作用，還有待進一步研究探索。因此，進一步深入系統地研究巨噬細胞在骨骼肌損傷再生過程中的調控機制，將為探索出以調控巨噬細胞促進骨骼肌損傷再生為重要方向的治療方法提供新的思路和靶點，可能成為今后研究的熱點之一。