弗林蛋白酶裂解位點在微生物感染宿主中的作用

高明燕 姜 逸 程 旭 俞 燕 范建華 孟 闖

1.中國農業科學院家禽研究所，江蘇揚州 225125；2.江蘇省人獸共患病學重點實驗室/江蘇省高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇揚州 225009

弗林蛋白酶（Furin）裂解位點廣泛存在于微生物前體蛋白中，如綠膿桿菌外毒素A、白喉毒素和炭疽毒素等細菌外毒素以及人免疫缺陷綜合征病毒、埃博拉病毒、麻疹病毒、乙肝病毒、流感病毒等很多病毒的囊膜糖蛋白。這些病原前體蛋白需要宿主細胞中的Furin 裂解成成熟蛋白才能在感染宿主的進程中進一步發揮作用。微生物前體蛋白上Furin 裂解位點的作用關鍵而重要，故本文將從Furin裂解位點的特點、病毒囊膜蛋白Furin裂解位點與病原感染宿主過程中毒力、宿主和細胞嗜性的相關性及其對微生物傳播效率和規模的影響等方面進行詳細綜述。

1 弗林蛋白酶及其裂解位點特點

Furin 是真核動物體內一種高度特異性的絲氨酸內切蛋白酶，屬于前體蛋白轉化酶家族，能識別切割前體蛋白進而激活其活性。其廣泛存在于各種組織和細胞中，主要定位于細胞高爾基體反面膜囊上。它作用的底物不僅包括宿主肽類激素和神經肽、生長因子、血清蛋白、基質金屬蛋白酶、受體等，還包括細菌外毒素和很多囊膜病毒的糖蛋白[1]。

Furin 能識別切割的最短序列特點是R-X-XR↓；其核心序列包括8 個氨基酸，順序為P6-P5-P3-P4-P3-P2-P1↓P1’P2’。裂解位點P1 和P4 位必須為R(精氨酸，Arg)；X 為任意氨基酸；若P2位為堿性的K（賴氨酸，Lys）或R 時，其切割效率能提高10 倍左右；此外P4 位不是R 時，P1 位必須是R，P2和P6 位是堿性氨基酸才能保證切割效率[2-3]。P2’位常可找到脂肪族氨基酸V（纈氨酸，Val）和I（異亮氨酸，Ile）。研究發現Furin 底物中裂解位點類型統計百分比：R-X-R–R↓為41%，R-X- K–R↓占31.5%，R-X-X-R ↓為11%，其他特殊位點占16.4%[4]。前體蛋白Furin 裂解位點可以在the ProP server上進行預測評分。

2 弗林蛋白酶裂解位點在微生物感染宿主中的作用

微生物前體蛋白上的Furin 裂解位點主要作用是被宿主Furin 識別并裂解活化，從而使病原微生物進入細胞并發揮致病作用，但不同微生物中Furin裂解位點的作用和影響并不完全相同。宿主Furin參與識別切割HIV-1 囊膜糖蛋白gp160 的裂解位點；而Furin 抑制劑可以抑制gp160 裂解成gp41 和gp120，從而阻止HIV-1的感染[5]。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）血凝素HA 和新城疫病毒（newcastledisease virus，NDV）融合蛋白F Furin 酶切位點不僅能夠被宿主細胞識別切割，還與病毒毒力高度相關。H5 和H7 高致病性AIV HA 切割位點上游均含有多個堿性氨基酸，其最小結構正是Furin 識別的R-K-K-R↓；而低致病性AIV HA 裂解位點上游只有一個堿性氨基酸R[6-7]，只能被部分組織中的堿性蛋白酶切割，從而影響病毒毒力。NDV 典型強毒株融合蛋白F 的裂解位點也存在多個堿性氨基酸R/KRQR/KR↓，而所有弱毒株F 蛋白位點具有共性的序列RQGR↓，它符合Furin 底物特性，但其酶切效率可能較低，從而影響了病毒的毒力[8]。

在病毒組裝過程中，由于部分β 屬和所有γ 屬冠狀病毒S蛋白上存在Furin 裂解位點，因此能被宿主細胞高爾基體Furin 識別裂解為S1/S2。此外，MERS-Cov、SARS-Cov2 和IBV 等冠狀病毒S 蛋白Furin 裂解位點變異和宿主與細胞嗜性相關。Yang等[9]發現MERS-Cov S 蛋白在748 位存在Furin 酶切位點（RSVR），而從蝙蝠上分離的與其同源性最高的HKU-4 S 蛋白缺失相應的酶切位點；人為引入突變S746位R 構成相應位置的酶切位點后，在無外源蛋白酶作用下H-Cov-HKU4 假病毒可以感染人體細胞；同時將MERS-Cov的Furin酶切位點突變替換成H-Cov-HKU4 S 蛋白相應的氨基酸后，MERSCov 的S 蛋白則完全失去活性。同樣有研究發現，SARS-Cov2 S 蛋白上Furin 酶切位點PRRAR↓的引入可能成為其跨宿主傳播的關鍵因素[10]。Yamada等[11]研究發現，IBV Beaudette vero 細胞適應株在S1/S2 之間Furin 裂解位點RRFRR↓下游產生了第2 個Furin 裂解位點HRRR↓；將S1/S2 之間的Furin 酶切位點缺失和突變為AAFAA 后，S1/S2 不能裂解，但病毒仍然能夠在Vero 細胞中增殖并形成合胞體，細胞適應株產生的第2 個Furin 裂解位點可能與病毒適應Vero 細胞從而發生變異有關；目前雞體天然分離IBV毒株不存在第二個Furin酶切位點，一般也不能在Vero細胞上生長。

Furin 裂解位點類型可能是病毒傳播效率和規模影響因素之一。筆者通過對GenBank 中國內外400多個IBV 毒株S 蛋白的Furin 裂解位點統計分析發現：IBV 的裂解位點類型有40 多種；但分離數量多，流行規模大的優勢毒株裂解位點主要有3個，包括RRFRR↓、RRSRR↓和HRRRR↓；而且這幾種裂解位點類型符合Furin高效的切割規律。

3 總結與展望

雖然現有研究已經明確了部分病原Furin 裂解位點在微生物感染宿主的過程中的作用，如參與囊膜糖蛋白的裂解活化和病毒宿主膜融合、影響病毒毒力和跨宿主傳播等。但不同病毒囊膜蛋白Furin裂解位點的作用和功能不完全相同，如AIV HA 蛋白和ND F蛋白與毒力相關，但IBV強毒分離株雞胚傳代致弱后，其S蛋白裂解位點類型沒有發生變化，IBV 毒力與其S 蛋白裂解位點類型關系以及其他作用并沒有明確。這有待于進一步深入研究，從而為揭示IBV 以及其他病毒入侵宿主細胞的致病機制、研制相應的阻斷藥物奠定基礎[12]。