甲基苯丙胺誘導神經細胞凋亡的研究進展

劉鵬亮，朱婷娜，楊根夢，王上，沈寶玉，董文娟，于浩，李利華，洪仕君，趙永娜

(1.昆明醫科大學法醫學院，昆明 650500； 2.昆明醫科大學藥學院，昆明 650500)

甲基苯丙胺又稱甲基安非他明、去氧麻黃素，屬于苯丙胺類中樞興奮劑，因其外觀呈透明結晶樣，純品像冰糖，俗稱“冰毒”，是繼海洛因后最為流行的毒品之一。甲基苯丙胺具有成癮快、復吸率高、精神依賴性極強等特點，長期濫用對神經系統造成顯著的毒性作用，并對身體上各器官均有損害，短期大量吸食極易引起猝死。《2019年中國毒品形勢報告》指出，目前我國甲基苯丙胺濫用人數占現有吸毒人員的55.2%(118.6萬/214.8萬)[1]。此外，甲基苯丙胺濫用者共用未經消毒的注射器和不潔性行為，使人類免疫缺陷病毒的感染及傳播風險增加，給家庭和社會帶來極大危害，現已成為全國乃至全世界亟須解決的公共衛生問題。凋亡是指機體調控自主發生的細胞程序性死亡的過程，是機體生長發育過程中的一種基本生物學反應，在多細胞生物體內去除異常或衰老的細胞中起必要作用，其參與了生物體的進化、內環境的調節以及不同組織器官的發育。多項研究表明，甲基苯丙胺導致的腦部損傷與一些退行性病變(如阿爾茨海默病、帕金森病)所表現的腦部病理變化極其相似[2-6]，而凋亡參與了甲基苯丙胺誘導神經毒性的發生發展過程，但具體作用機制尚未清楚。現就甲基苯丙胺誘導神經細胞凋亡的研究進展予以綜述，以期為研究甲基苯丙胺與凋亡相關機制以及發現新的治療藥物的提供依據。

1 凋亡概述

凋亡的概念由Kerr在1972年根據其形態學特征首次提出[7]。細胞凋亡早期細胞質凝結，細胞器之間更緊密，細胞質密度升高、細胞體積縮小，細胞核內染色體降解、凝聚，這也是凋亡最主要的特征。隨后細胞膜的連續性中斷，細胞核碎裂，細胞被分割成為數個凋亡小體，被周圍的吞噬細胞吞噬并消化。凋亡在多細胞生物的組織分化、生長發育及機體穩態的維持中起重要作用。異常的細胞凋亡使正常的神經受到損傷，受損后的神經變性導致多種神經退行性疾病的發生[8]。B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因是調節細胞凋亡基因中的一員，其可以抑制凋亡作用，延長細胞生存時間；而Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)基因是凋亡正性調控因子，可以促進細胞凋亡的發生，細胞中Bcl-2和Bax基因的比例可以對細胞凋亡進行調節。凋亡主要表現為胱天蛋白酶(caspase)家族的激活，caspase在神經細胞凋亡中起殺傷蛋白的作用[9]；多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]是一種真核細胞的核內酶，其分子量為113 000，在細胞凋亡過程中，PARP被caspase蛋白水解為分子量為89 000和24 000的兩個片段，這兩個片段成為細胞凋亡的發生標志。因此，目前可通過檢測Bcl-2、Bax、caspase和PARP等相關蛋白的變化來判斷細胞的凋亡情況。

2 甲基苯丙胺誘導神經細胞凋亡

體外研究表明，不同劑量甲基苯丙胺(0、1、2、2.5、3、3.5 mmol/L)處理PC12細胞和SH-SY5Y細胞的caspase-11表達量均升高，且caspase-11表達量與甲基苯丙胺劑量在16 h內呈依賴性增加[9]。甲基苯丙胺可以誘導PC12細胞和SH-SY5Y細胞發生凋亡和自噬，并使caspase-3、PARP、CCAAT/增強子結合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBPβ)的表達。用1.0 mmol/L甲基苯丙胺處理原代培養的紋狀體神經元，觀察到caspase-3、PARP和C/EBPβ的表達水平顯著增加[10]。Xu等[11]用3.0 mmol/L甲基苯丙胺處理PC12細胞，發現TdT介導的dUTP缺口末端標記法(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)染色陽性細胞數目顯著增加，同時凋亡標志物PARP和caspase-3的表達水平有所增加。Huang等[12]發現，甲基苯丙胺可通過C/EBPβ/Tribble同源蛋白3/Parkin/α-syn信號通路促進SH-SY5Y細胞發生凋亡。另有前期研究發現，不同劑量甲基苯丙胺(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L)處理新生SD大鼠皮質神經元24 h，隨著甲基苯丙胺濃度的增加，神經元突觸逐漸縮短，胞體逐漸出現皺縮、空泡化，甚至死亡，發現經TdT介導的dUTP缺口末端標記法染色陽性細胞的數量明顯增多[13]。Ma等[14]證實，大鼠皮質神經元細胞凋亡數量與甲基苯丙胺呈劑量依賴性，細胞存活率降低。

體內研究表明，甲基苯丙胺可誘導大鼠腦組織caspase-11表達增加，并明顯上調凋亡標志物caspase-3和PARP的表達[9]。此外，甲基苯丙胺可增加大鼠紋狀體中caspase-3、PARP和C/EBPβ的表達水平[10]。Xu等[11]研究表明，capsase-3信號通路參與了核蛋白1介導的多巴胺能神經元凋亡。Huang等[12]發現，C/EBPβ參與甲基苯丙胺誘導多巴胺能神經元凋亡，且大鼠紋狀體中caspase-3和PARP的表達水平增加。由此可見，甲基苯丙胺可以誘導神經細胞發生凋亡。

3 甲基苯丙胺誘導神經細胞凋亡的主要信號傳導通路

細胞凋亡的發生和調控與多條信號傳導通路有關，主要有外源性的死亡受體途徑、內源性的線粒體途徑和內質網應激途徑等。

3.1死亡受體途徑的調控作用 死亡受體是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成員，與相關配體結合后，其內部死亡結構域暴露并聚集，并與caspase-8前體結合并活化caspase-8蛋白，從而引發細胞凋亡。死亡受體有Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2等，目前Fas/Fas配體和TNFR介導的凋亡研究最多。研究發現，TNF-α和Fas配體在神經系統中用過炎癥反應誘導神經細胞凋亡[15]。既往研究發現，甲基苯丙胺可致大鼠神經元損傷，并增加大鼠額葉皮質炎癥因子TNF-α和白細胞介素-6的表達[16]。研究表明，甲基苯丙胺可促進Fas相關死亡域蛋白向磷酸化Fas相關死亡域蛋白的轉化，且甲基苯丙胺的需求量增加，其在海馬區的表達明顯高于紋狀體[17]。Park等[18]用1.0 mmol/L甲基苯丙胺處理SH-SY5Y細胞12 h發現，TNFR、caspase-3、PARP、Bax蛋白表達水平顯著升高。此外，Liou等[19]研究證明，甲基苯丙胺會促進心肌細胞的凋亡，同時Fas、Fas配體、TNFR、TNF-α、caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表達水平有所增加，而Bcl-2表達水平降低。可見，甲基苯丙胺可通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡。

3.2線粒體途徑的調控作用 甲基苯丙胺可通過經典線粒體途徑誘導細胞凋亡。線粒體途徑是大多數脊椎動物發生細胞凋亡的主要形式[20]。Bax蛋白與線粒體通透性轉換孔結合使其持續開放，導致細胞膜電位消失，促進細胞色素C(cytochrome C，CytC)的釋放并與凋亡蛋白酶活化因子1和caspase-9結合，繼而活化下游caspase-3蛋白引發凋亡，而Bcl-2和Bcl-xL通過與Bax競爭性結合線粒體通透性轉換孔抑制凋亡發生。研究顯示，甲基苯丙胺處理C6細胞的CytC、caspase-9、caspase-3、Bax表達水平升高，而Bcl-xL的表達水平降低，表明甲基苯丙胺可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[21]。Chen等[22]研究證明，甲基苯丙胺在體內、體外均可以通過上調來自星形膠質細胞的Lipocalin-2表達增加CytC、caspase-3、PARP、Bax蛋白的表達，從而參與線粒體相關的神經元凋亡。甲基苯丙胺處理PC12細胞和SH-SY5Y細胞用的線粒體膜電位降低，且線粒體內CytC表達明顯增加[10]。此外，Huang等[12]研究表明，C/EBPβ可通過Tribble同源蛋白3/Parkin/α-syn信號軸介導甲基苯丙胺誘導的線粒體凋亡。Sharikova等[23]發現，甲基苯丙胺處理HUTU小膠質細胞的CytC、髓細胞白血病因子1、凋亡蛋白酶活化因子1、Bax和caspase-3表達水平增加，證實甲基苯丙胺可通過線粒體途徑誘導神經細胞發生凋亡。除CytC介導細胞凋亡外，凋亡誘導因子介導的非caspase依賴的凋亡通路受Bax和Bcl-2調控。有研究證明，甲基苯丙胺也可通過促進凋亡誘導因子表達誘導細胞凋亡[24]。

3.3內質網應激途徑的調控作用 甲基苯丙胺可以通過內質網應激途徑誘導細胞凋亡。內質網應激可激活未折疊蛋白反應來進行細胞修復，而持續性內質網應激會誘導細胞凋亡。未折疊蛋白反應主要與蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活轉錄因子6、肌醇需求酶-1有關。內質網應激通過激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)轉錄、激活c-Jun氨基端激酶信號通路、活化caspase-12三條途徑引發凋亡。研究表明，甲基苯丙胺可促進SH-SY5Y細胞發生內質網應激[10]。此外，甲基苯丙胺可通過上調大鼠前額葉皮質和紋狀體中核蛋白1和CHOP的表達而激活體內內質網應激[11]。星形膠質細胞來源的Lipocalin-2也可通過PERK介導的信號通路促進神經元凋亡。Shah和Kumar[25]用甲基苯丙胺處理SVGA細胞，發現PERK、轉錄因子6和肌醇需求酶-1被激活，且激活水平具有一定的時間和劑量依賴性，同時CHOP、caspase-9和caspase-12表達水平增加。甲基苯丙胺處理后，C6細胞的PERK、轉錄因子6和肌醇需求酶-1被激活，CHOP和caspase-12的表達水平增加[26]。Jayanthi等[24]證明，甲基苯丙胺可通過內質網應激途徑誘導神經細胞凋亡，甲基苯丙胺處理后，葡萄糖調節蛋白78/免疫球蛋白重鏈結合蛋白、CHOP和caspase-12的表達水平明顯升高，且注射甲基苯丙胺后，大鼠的caspase-12因子立即被激活。除神經系統外，甲基苯丙胺還可通過激活內質網應激誘導細胞凋亡，從而造成肺組織損傷[27-28]。

4 不同藥物在甲基苯丙胺誘導細胞凋亡中的調節作用

4.1天麻素對甲基苯丙胺誘導細胞凋亡的調節作用 天麻素是天麻的主要生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑制小膠質細胞活化、調節線粒體級聯、調節神經遞質、上調神經營養等作用，其對許多中樞神經系統疾病有廣泛益處。天麻素對甲基苯丙胺誘導的細胞凋亡具有保護作用。天麻素可以對神經損傷起到很好的保護作用，并通過上調Bcl-2表達、下調Bax和caspase-3表達，進而抑制神經元的凋亡[29-30]。天麻素可通過拮抗上調內質網應激的信號抑制細胞凋亡發生，可能與其抗氧化、抗炎的作用有關[31-33]。既往研究表明，給予天麻素干預并經甲基苯丙胺處理的皮質神經元經TdT介導的dUTP缺口末端標記法染色顯示陽性細胞的數量顯著減少，且caspase-3表達水平明顯降低[13]。此外，天麻素可通過調節環腺苷酸、蛋白激酶A、cAMP反應元件結合蛋白和腦源性神經營養因子的表達改善由甲基苯丙胺誘導的神經細胞凋亡引起的神經毒性作用[14]。Liu等[33]研究發現，天麻素可以減少線粒體膜電位的損失并抑制CytC、Bax和凋亡誘導因子的表達，從而抑制細胞凋亡。自噬和凋亡是兩種不同的程序性死亡方式，有研究表明，抑制甲基苯丙胺誘導的自噬可以減輕甲基苯丙胺誘導的凋亡[10]。Yang等[34]研究發現，天麻素可以通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路抑制甲基苯丙胺誘導的SH-SY5Y細胞自噬。

4.2褪黑素對甲基苯丙胺誘導凋亡的調節作用 褪黑素是哺乳動物和人類松果體產生的一種胺類激素，具有抗氧化、抗炎、調節免疫、抗腫瘤等作用。研究表明，褪黑素對甲基苯丙胺介導的神經細胞凋亡有保護作用[13]。同時，褪黑素還可以劑量依賴方式增加Bcl-xl/Bax比值，降低CytC、caspase-9和caspase-3的表達水平，改善甲基苯丙胺誘導的細胞凋亡[21]。此外，褪黑素可通過調節內質網應激抑制甲基苯丙胺誘導的細胞凋亡，并提高神經細胞活性和降低CHOP、caspase-12的表達水平[26,35]。攻擊性是甲基苯丙胺使用或戒斷后的癥狀之一，而褪黑素具有逆轉甲基苯丙胺誘導的攻擊性行為的能力[36]。此外，褪黑素還可通過對谷氨酸受體、突觸和腦源性神經營養因子的保護和恢復作用，改善甲基苯丙胺造成的神經損傷和學習、記憶以及認知功能障礙[37]。蛋白激酶Cδ是新型蛋白激酶C家族成員，主要通過特定基因位點的磷酸化和caspase-3的剪切而被激活，從而介導細胞凋亡。Shin等[38]研究發現，褪黑素可通過調節蛋白激酶Cδ基因抑制細胞凋亡，從而降低甲基苯丙胺引起的神經毒性作用。

4.3其他藥物對甲基苯丙胺誘導凋亡的調節作用 積雪草酸[18]、人參皂苷Re[38]和木犀草素[39]等藥物均能抑制甲基苯丙胺誘導的細胞凋亡。積雪草酸來自中草藥積雪草，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎等特性。積雪草酸抑制甲基苯丙胺誘導的TNFR表達具有劑量依賴性，其還可通過增加Bcl-2/Bax比例抑制細胞凋亡，使caspase-3及PARP的表達降低[18]。人參皂苷Re是人參的主要活性成分之一，Shin等[38]研究證實，人參皂苷Re可以通過蛋白激酶Cδ途徑抑制線粒體損傷、酶抗氧化系統損傷和小膠質細胞的激活與凋亡來保護多巴胺能神經免受甲基苯丙胺誘導的神經毒性作用。木犀草素是一種黃酮類化合物，普遍存在于水果、蔬菜及草本植物中，在中醫藥領域廣泛應用。木犀草素可通過降低p53、caspase-3、Bax表達抑制甲基苯丙胺對神經系統發揮的毒性作用；并可抑制神經細胞發生自噬，降低Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ的表達，這可能是木犀草素保護神經系統的作用機制之一[39]。

綜上所述，甲基苯丙胺可誘導神經細胞凋亡，而天麻素、褪黑素、積雪草酸、人參皂苷Re和木犀草素等主要通過較強的抗氧化性抑制甲基苯丙胺誘導的凋亡和神經毒性，證實甲基苯丙胺可通過激活氧化應激誘導神經毒性作用，為尋找甲基苯丙胺戒斷干預治療藥物和作用靶點提供了依據。

5 小 結

細胞凋亡是多細胞生物體內的正常生理反應，正常的凋亡可以清除體內的異常細胞，維持內環境穩定，異常的凋亡在導致機體損傷中發揮重要作用。甲基苯丙胺通過促進死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網應激途徑相關因子的表達誘發異常的神經細胞凋亡，從而誘導神經毒性作用，其具體調控機制尚不清楚。因此，探究甲基苯丙胺毒性作用與凋亡之間的機制、信號傳導通路和關鍵作用蛋白，可為甲基苯丙胺依賴者的靶向治療提供新思路和新方法，并將成為該領域的研究方向和最終目標。