膠質母細胞瘤中EGFRvⅢ及其靶向治療研究進展

馬亞光,龍宇，胡力，沈紅，劉利，林志國

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經外科四，哈爾濱 150001)

膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的惡性原發性腦腫瘤，約占所有膠質瘤的57%，占所有原發性惡性中樞神經系統腫瘤的48%[1]。其預后差，復發率高，生存率低，5年生存率為4%～5%[2]。目前，GBM的有效治療方法仍為手術切除，術后再輔助放療、化療、免疫治療、光動力治療、電場療法等，效果不理想。鑒于目前的有效治療方式，靶向治療可以作為GBM的有效治療策略之一。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在不同的癌癥中常高水平表達，且其表達水平與癌癥進展和不良預后呈正相關，EGFR的不同突變形式會導致癌癥的異質性[3]，最常見的為表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)，EGFR的突變常見于GBM，其中EGFRvⅢ在中GBM的編碼突變率約為50%，且高達28%～30%的GBM細胞上特異性存在EGFRvⅢ[4-5]。另有研究證明，EGFRvⅢ陽性患者生存期較短[6]。EGFRvⅢ在25%～30%的GBM中表達，且只能在腫瘤組織細胞表達，這可能是EGFR基因擴增重排最常見的結果[7]。然而，GBM的靶點機制尚不明確，導致相關靶向性治療效果不明顯。鑒于EGFRvⅢ在GBM的生長中起促進作用，現就GBM中EGFRvⅢ及其靶向治療研究進展予以綜述。

1 EGFR的分子結構功能

EGFR是一種分子量為170 000的跨膜蛋白，屬于酪氨酸激酶受體家族[8]。酪氨酸激酶受體家族成員具有相似的結構，包括：①具有兩個富含半胱氨酸區域的胞外結構域；②單個跨膜區域；③含有多個酪氨酸的胞質結構域。EGFR由表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)家族的成員激活，包括EGF、雙調蛋白、轉化生長因子-α、肝素結合性表皮生長因子和上皮調節蛋白[9]。這些因子的結合參與細胞分裂、存活及細胞死亡的磷酸化級聯反應和下游途徑信號轉導。EGFR家族是一個復雜的系統，參與生長因子細胞信號傳遞。在質膜上，EGFR的磷酸化通過識別和結合Src同源區2和磷酸酪氨酸結合結構域到受體上的磷酸酪氨酸基序，導致多種效應蛋白的募集。EGFR可以參與和調節許多信號通路，如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、RAS/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和Janus激酶(Janus kinase，JAK)2/信號轉導及轉錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)[10-11]。在正常細胞中，EGFR通過配體誘導的受體二聚化和酪氨酸自磷酸化在GBM的細胞增殖中起作用。在腫瘤中，EGF與配體結合后通過受體磷酸化而激活受體酪氨酸激酶/RAS/PI3K通路，該信號通路的激活能促進腫瘤細胞增殖、血管生成和對局部組織侵襲[12]。

2 EGFRvⅢ在GBM中的形成機制

EGFR基因位于人類染色體7p11～13上，長度約110 Kb。在GBM中，EGFR缺失包括EGFRvⅠ缺失(N端缺失)、EGFRvⅡ缺失(外顯子缺失14～15)、EGFRvⅢ缺失(外顯子缺失2～7)、EGFRvⅣ缺失(外顯子缺失25～27)、EGFRvⅤ缺失(外顯子缺失)[13]。在GBM中，最常見的為編碼野生型EGFR及其突變體EGFRvⅢ的擴增。EGFRvⅢ突變導致野生型EGFR基因外顯因子2和7間801個堿基對的缺失，最終使胞外結構域的6～273個氨基酸產生框內截斷，影響氨基酸二聚化及與配體的結合，因而不具有與EGF結合的能力[14]。這種突變在腫瘤表面形成特異性抗原表位，EGFRvⅢ的這種特性能有效避免在治療過程中對正常腦組織損害，故使其成為潛在治療靶點。EGFRvⅢ能夠在GBM中表達，還可能與野生型EGFR DNA擴增相關，其能將突變基因轉移到缺乏這種改變的細胞中[15]；具有擴增子的細胞實驗顯示，具有突變的細胞經過染色體外DNA元素感染結果表明細胞中缺乏擴增子，導致EGFRvⅢ中的細胞表達為陽性，繼續維持細胞生長[16]。研究證明，EGFRvⅢ僅在腫瘤表達，在正常組織中無法檢測到，因此EGFRvⅢ可以作為精準靶點藥物治療的選擇對象[17]。

3 EGFRvⅢ表達與GBM的關系

根據世界衛生組織膠質瘤分級，GBM屬于Ⅳ級，惡性程度最高。在GBM中，約60%為原發性，其余則由低級別腦膠質瘤經惡性轉化而來。Yang等[18]通過研究EGFRvⅢ對中國人腦膠質瘤預后的影響發現，在240例膠質瘤患者中有73例檢測到EGFRvⅢ表達(中度陽性和強烈陽性)，且EGFRvⅢ的表達率越高，陽性程度越強，表明膠質瘤級別與ERFGvⅢ表達水平呈正相關。此外，腫瘤細胞侵襲和遷移不可避免地依賴或釋放基質成分，均與基質降解蛋白酶的蛋白水解酶活性增加有關，且它們在膠質瘤中上調均與EGFR和EGFRvⅢ的上調有關，如EGFRvⅢ的表達與基質金屬蛋白酶9的表達密切相關，因為EGFRvⅢ可通過激活膠質瘤細胞中的胞外信號調節激酶(extracellular singal-regulated kinase，ERK)增加基質金屬蛋白酶9的表達來促進膠質瘤細胞的侵襲性。

4 EGFRvⅢ介導的信號通路參與GBM發生的機制

4.1PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路 PI3K/Akt/mTOR信號通路在促進腫瘤細胞增殖、凋亡、自噬和代謝中起關鍵作用[19]。該信號通路激活能使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，并進一步激活Akt和mTOR。激活的mTOR復合物2能通過磷酸化作用激活Akt信號通路，同時失去人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因主要抑制因子，失去抑制因子的Akt信號通路無法阻止磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的去磷酸化進行負反饋調節PI3K/Akt通路，導致Akt信號通路在細胞質中無法重新定位，從而再一次激活Akt和mTOR[20-21]。另外，PI3K具有獨立p85調節亞基家族性激酶異二聚體，通過p85-p110復合物或RAS直接或間接激活PI3K/Akt通路[19]。而EGFRvⅢ參與該信號通路，因為EGFRvⅢ具有配體和非依賴性酪氨酸激酶能夠以自磷酸化的方式激活PI3K，激活后的PI3K進一步磷酸化Akt蛋白，激活Akt依次磷酸化下游通路分子，以調節代謝、細胞生長、血管生成、運動和凋亡[6]。

4.2JAK/STAT信號通路 在GBM中，EGFRvⅢ在通過JAK-STAT信號通路促進GBM形成機制中起重要作用。當STAT被JAK磷酸化時，非活性胞質STAT單體胞質發生構象變化，形成活性同二聚體、異二聚體或四聚體，激活的STAT可以轉移到細胞核中，作為轉錄因子來調節基因表達[22-23]。研究發現，EGFRvⅢ不能結合EGF配體或被EGF配體激活導致EGFR磷酸化，磷酸化的EGFRvⅢ被轉移到細胞核中形成一個復合物，從而增強STAT3的磷酸化；同時，該研究還發現野生型EGFR和EGFRvⅢ細胞中的共同表達表型能增加STAT3和STAT5的磷酸化，并通過促進腫瘤免疫抑制環境的形成，使其共同表達腫瘤惡性程度明顯高于單一受體表型[14]。可見，EGFRvⅢ不僅具有促進腫瘤細胞自我更新、增殖和侵襲的作用，還起到腫瘤免疫抑制作用。

4.3RAS/MAPK/ERK信號通路 在所有信號網絡通路中，ERK是MAPK的家族成員，其是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種傳遞絲裂原的信號傳遞蛋白，而ERK/MAPK信號通路是調節細胞生長、發育和分裂的核心[24]。由于EGFRvⅢ胞外域的缺失，其不能與EGF結合，僅能結合含有Src同源區2結構域的生長因子受體結合蛋白2，促進RAS蛋白激活，激活的RAS驅動RAF-MAPK/ERK信號級聯，同時信號通路中的ERK激活反過來磷酸化大量下游底物并轉移到細胞核中，以調節一系列蛋白質和轉錄因子活性，促進腫瘤細胞生長[25-26]。

4.4Src家族激酶(Src family kinase，SFK)信號通路 研究發現，SFK、Fyn和Src是致癌EGFR信號的效應因子，這些效應因子能夠增強腫瘤細胞的侵襲和在體內的存活，而EGFRvⅢ的表達導致酪氨酸磷酸化的激活，促進腫瘤的生長和運動[27]。EGFRvⅢ(也稱為de2-7EGFR)在GBM中常與EGFR共同表達，它通過SFK依賴的Dock180磷酸化促進腫瘤發生，Dock180是Rac1鳥嘌呤核苷酸交換因子，可激活Rac1，參與調節細胞運動和侵襲。同時，EGFRvⅢ還可誘導酪氨酸殘基722位點Dock180磷酸化，并刺激Rac1信號轉導，導致GBM細胞存活和遷移[28]。

5 EGFRvⅢ參與GBM的靶向性治療

目前，通過了解EGFR/EGFRvⅢ在GBM中的發生機制，已將EGFR/EGFRvⅢ作為一個理想的靶點，且針對EGFR/EGFRvⅢ靶點研制出多種治療方法，包括EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制劑治療、EGFR/EGFRvⅢ抗體治療、EGFR/EGFRvⅢ介導相關疫苗治療、嵌合抗原受體T細胞免疫治療(chimeric antigen receptors T-cell immunotherapy，CAR-T)等。

5.1EGFR/EGFRvⅢ小分子抑制劑治療 EGFR在腫瘤細胞增殖、侵襲和抗凋亡中起重要作用，其在GBM中發生擴增和表達；EGFRvⅢ是EGFR的一種活躍突變形式，驅動GBM亞群生長，使小分子靶向治療成為有效治療方案[29]。其中，第一代藥物EGFR抑制劑被設計為原位阻斷酪氨酸激酶結構域內EGFR/ATP結合位點，阻斷EGFR激活，代表藥物有吉非替尼、埃羅替尼和拉帕替尼[30]。由于酪氨酸激酶結構外顯子的突變不存在GBM患者中，故第一代藥物治療效果不明顯[10]。第二代藥物EGFR-酪氨酸激酶抑制劑被設計為不可逆的EGFR與其他ERBB家族成員酪氨酸激酶結合，代表藥物有阿法替尼，但目前關于第二代藥物治療GBM患者的有效劑量仍需進一步臨床試驗驗證[31-32]。第三代藥物是一種不可逆抑制劑，具有抗EGFR突變體(T790M、L858R、外顯子19活性缺失)，同時保留野生型EGFR[33]。如第三代藥物羅西替尼正在進行臨床試驗，雖然T790M突變在GBM患者中并不常見，但仍可以作為一個備選靶點基因[34]。

5.2EGFR/EGFRvⅢ抗體治療 與野生型EGFR相比，EGFRvⅢ由于配體結合域缺失突變，其對L2結構域抗體不敏感[35]。目前，臨床批準針對EGFR的抗體包括西妥昔單抗、帕尼單抗和尼妥珠單抗。EGFRVⅢ靶向抗體包括西妥昔單抗、奈昔拖珠單抗、尼妥珠單抗，這些單抗均不能抑制EGFRvⅢ的激活，而帕尼單抗是唯一能夠同時消除EGFRvⅢ和野生型EGFR的抗體，導致p-S6信號通路受到抑制，從而在體內外具有抗腫瘤活性[36]。由于血腦屏障作用，EGFR/EGFRvⅢ抗體治療GBM仍面臨嚴峻挑戰。

5.3EGFRvⅢ介導相關疫苗治療 抗GBM疫苗(如Glio Vac)是一種滅活腫瘤細胞的復合物[37]。目前針對以EGFRvⅢ為靶點學者研究出主動和被動免疫的特異性疫苗，其中多肽疫苗在治療腫瘤過程中發揮免疫作用[38]。EGFRvⅢ是一種腫瘤抗原，且僅表達于腫瘤組織中，其能夠成為主動免疫治療的目標。ridopepimut(CDX-110)是經過EGFRvⅢ氨基酸序列重新連接合成的由14-聚體肽組成的多肽疫苗，可以誘導EGFRvⅢ特異性的體液和細胞免疫應答，該疫苗的特異性可能與EGFRvⅢ在GBM細胞上的獨立表達有關[39]。由于ridopepimut的有效性和安全性，其能夠成為一個極具前景的GBM治療策略。

5.4CAR-T 嵌合抗原受體是人工融合蛋白，包括細胞外抗原識別域、跨膜域和細胞內T細胞信號域。CAR-T是通過對T細胞進行修飾，導致T細胞表達腫瘤抗原的嵌合抗原受體，從而特異性識別腫瘤抗原，清除癌細胞，達到臨床緩解并根治腫瘤的目的[40]。在小鼠模型中，以EGFRvⅢ突變為靶標的嵌合抗原受體能夠識別并消除表達其靶點的細胞[41]。另一項Ⅰ/Ⅱ期試驗顯示，在表達EGFRvⅢ的惡性膠質瘤患者中，使用嵌合抗原受體T細胞與抗EGFRvⅢ人139-scFv、CD28和4-1BB共同刺激結構域，結果顯示CAR-T無任何不良反應[42]。一項測試利用嵌合抗原受體治療以EGFRvⅢ為靶點的GBM患者，結果顯示其能夠提高患者生存率[40]。另有研究顯示，在膠質瘤模型中發現嵌合抗原受體修飾免疫細胞能夠穿透血腦屏障，為GBM患者提供潛在的治療方案[43]。

5.5雙特異性T細胞銜接器(bispecific T-cell engagers，BiTEs)治療 BiTEs是一種通過基因工程改造的融合的二價單克隆抗體，可與兩個不同抗體的單鏈可變片段相互作用：一種抗體片段與T細胞結合，另一個片段與腫瘤細胞的抗原結合，同時結合腫瘤細胞上的抗原和T細胞上的表面分子來誘導腫瘤溶解[44]。Gardell等[45]研究發現，通過篩選巨噬細胞分泌一種病毒編碼，針對功能性靶向性EGFRvⅢ的BiTE蛋白，能夠誘導T細胞活化、增殖、脫顆粒和殺死抗原特異性腫瘤細胞。AMG 596是一種BiTEs免疫腫瘤治療方法，它由兩個單鏈可變片段組成，通過兩個單鏈可變片段與GBM細胞上的腫瘤特異性抗原、EGFRvⅢ和T細胞上的CD3結合，從而激活T細胞增殖和分泌細胞毒性物質，誘導腫瘤細胞溶解[46]。雖然BiTE治療神經膠質瘤的應用尚未進入臨床試驗，但其抑制腫瘤的作用得到進一步證實。

6 小 結

EGFRvⅢ獨特的分子結構及相關信號網絡通路為GBM的治療提供新靶點，目前隨著分子生物學發展，EGFR和EGFRvⅢ在GBM的作用中得到有效的驗證。雖然對EGFR信號通路的理解取得明顯進步，但是針對EGFR和EGFRvⅢ的治療未顯示明顯臨床獲益。且復雜的信號調控網絡、低效率的血腦屏障穿透、腫瘤的異質性和次級突變增強了GBM的耐藥性。EGFRvⅢ靶向治療可能能有效殺死EGFRvⅢ陽性的腫瘤細胞，但那些殘存下來的腫瘤細胞仍然依賴EGFR，應采取新的組合療法針對多個靶點進行治療。因此，未來應全面了解EGFRvⅢ的分子結構及相關信號網絡通路，以為GBM提供更有效的聯合治療方案。