原發性膽汁性膽管炎小鼠模型及其應用研究進展

王資隆，靳睿，封波

(北京大學人民醫院 北京大學肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點實驗室，北京100044)

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種由自身免疫介導、肝內膽管上皮細胞破壞導致的慢性膽汁淤積性肝病，以中年女性多見，臨床癥狀主要為疲乏無力和瘙癢;病理表現為肝匯管區淋巴細胞浸潤，選擇性侵犯膽小管上皮細胞，造成肝內膽汁淤積，最終發展為肝衰竭;血清與免疫學指標為出現特征性的自身抗體［主要為抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody，AMA)］、免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平升高［1］。其發病可能與遺傳、環境、免疫、藥物等因素有關，但具體病因與發病機制尚不明確。目前臨床治療中，尚有部分患者對熊去氧膽酸應答不佳，因此制備動物模型分析PBC病因、研究發病機制以及藥物篩選、預后具有重要價值。在動物模型中，倉鼠的膽汁酸合成和代謝與人類最為相似，但研究者普遍以小鼠為主要模型，是因其具有體積小、孕期短和壽命長可滿足實驗周期需要等優點，此外還培育了背景明確的不同品系轉基因小鼠，這對進一步探索疾病機制也有重要意義［2］。當前已構建多種具有人類PBC患者特征的小鼠模型，現就化學、生物誘導和基因修飾類PBC小鼠模型及其應用進展予以綜述。

1 化學誘導類小鼠模型

1.1 2－辛炔酸誘導模型 2－辛炔酸是人工合成的物質，化妝品和口香糖中均有存在，具有被AMA陽性的PBC血清所識別的異源修飾表位。Wakabayashi等［3］將2－辛炔酸與牛血清白蛋白耦合免疫C57BL/6小鼠發現，其表現出類似PBC患者的特征。2－辛炔酸誘導小鼠可產生AMA，血清中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)－α和γ干擾素(interferon，IFN)水平顯著升高;病理可觀察到匯管區大量以CD8+T為主的淋巴細胞浸潤，以及膽管缺失、上皮肉芽腫等。

2－辛炔酸誘導小鼠模型構建簡單，因此在機制研究及藥物研發等方面應用廣泛。研究者利用該小鼠模型對肝臟纖維化進行了不同探索，如Hsueh等［4］發現，外源性白細胞介素(interleukin，IL)－10可增加肝臟炎癥與纖維化，這可能與其招募和激活CD4+T、CD8+T、自然殺傷和自然殺傷T細胞并增加膽管損傷有關;Hintermann等［5］發現，緊密連接黏附分子B和C在小鼠肝血管系統中上調，提示肝臟纖維化與其有關。也有研究者將人臍帶源性間充質干細胞與2－辛炔酸－牛血清蛋白共同注射，結果顯示其減弱了PBC的誘導過程［6］，這為臨床治療提供了新思路。

2－辛炔酸誘導小鼠在免疫學、血清學和病理上與人類疾病非常相似，尤其是淋巴細胞浸潤類型。此外，還出現了特征性的單核細胞浸潤與上皮肉芽腫。但該小鼠模型沒有性別差異，且在肝臟病理中未觀察到任何脂肪變性、嗜酸粒細胞增多癥或膽汁淤積癥的證據，也未觀察到肝臟纖維化。

1.2 聚肌胞苷酸誘導模型 研究發現使用Ⅰ型IFN治療的過程中，PBC癥狀會加重［7］。而聚肌胞苷酸可以誘導產生Ⅰ型IFN，并影響自身免疫。因此研究者嘗試向小鼠注射聚肌胞苷酸，結果顯示其表現出類似PBC的特征［8］。在24周時，大部分小鼠可檢測到AMA，血清中細胞因子IL－12p70、IL－10、單核細胞趨化蛋白、IFN－γ和IL－6、丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平升高;肝組織病理可觀察到淋巴細胞浸潤，CD8+T細胞主要集中在膽管附近。此外，該模型還出現了肝外器官的自身免疫病變，如腮腺炎、胰腺炎和間質性腎炎［8］。

聚肌胞苷酸誘導模型操作簡單，且能出現肝臟以外自身免疫表現，故可用于分析PBC早期肝組織淋巴細胞浸潤情況，也可用于新型藥物的研發和治療方案的篩選。Li等［9］發現，沉默信息調節因子1激活劑白藜蘆醇可顯著改善肝損傷與降低轉氨酶水平，提示激活沉默信息調節因子1信號通路可能是PBC治療的新靶點。但該模型無明確的雌性優勢，肝臟病理與人類PBC也有較大區別，并沒有出現肉芽腫和嗜酸粒細胞。

2 生物誘導類小鼠模型

2.1 新鞘脂菌誘導模型 新鞘脂菌是一種可以代謝血紅蛋白和雌性激素的細菌，被認為是PBC的重要致病因素，其兩種蛋白質氨基酸序列與人抗丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex E2，PDC－E2)的主要免疫原性脂化結構呈高度同源性［10］。

有研究者將新鞘脂菌5×107CFU(菌落形成單位)靜脈注射到C57BL/6、NOD和SJL系小鼠體內發現，其均表現出類似PBC的慢性病變［11］。新鞘脂菌誘導的小鼠模型產生了針對PDC－E2的IgG和IgA抗體;病理顯示門靜脈炎癥伴大量淋巴細胞浸潤、膽管損傷和膽囊破壞以及肉芽腫形成［11］。Arsenijevic等［12］發現，半乳凝素－3缺失和半乳凝素－3抑制劑均可減輕新鞘脂菌誘導模型的膽管損傷，提示抑制半乳凝素－3可能是PBC的潛在治療策略。

新鞘脂菌誘導模型造模時間短，出現特異性的抗體，且病理表現與人類極為相似，但同樣無雌性優勢，也未出現肝纖維化表現。

2.2 大腸埃希菌誘導模型 PBC發病可能與病原微生物感染有關，病原微生物通過分子模擬自身抗原來誘發自身免疫反應。人PDC－E2與大腸埃希菌PDC－E2具有交叉識別機制［13］，高度相似的非PDC－E2微生物序列存在于大腸埃希菌等細菌內。

研究者給NOD.B6 Idd10/Idd18小鼠靜脈注射大腸埃希菌，小鼠出現了AMA和膽管損傷，肝臟病變與人類PBC門靜脈浸潤十分相似，血清中檢測到PDC－E2和2－酮戊二酸脫氫酶復合體E2亞基抗體，其中PDC－E2抗體在感染4周后達到高峰［14］。但該模型注射大腸埃希菌19周后并未出現顯著的肝臟病理改變，直到26周才觀察到明顯的門靜脈炎癥并伴有肉芽腫形成，不同程度的膽管細胞損傷，部分膽管有輕微的淋巴樣細胞浸潤，而部分膽管上皮細胞完全消失。

大腸埃希菌誘導模型常用于發病危險因素的研究，除家族遺傳等因素外，尿路感染也是其發病因素［10］。通過大腸埃希菌尿路感染誘導的小鼠模型發現，其組織學和免疫學特征與PBC患者相似，包括膽管破壞、肉芽腫形成和淋巴細胞浸潤［15］。

3 基因修飾類小鼠模型

3.1 NOD.c3c4小鼠模型 NOD小鼠模型是一種成熟的自身免疫1型糖尿病動物模型，NOD.c3c4來源于NOD小鼠，具有異常的細胞增殖和無細胞凋亡特性，有助于膽管囊腫的形成，這一缺陷加速了小鼠的自身免疫反應［16］，模擬了PBC患者的某些特征。NOD.c3c4小鼠體內可出現AMA、抗核抗體和抗－Sm抗體，血清中丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平均升高。病理可觀察到早期囊腫形成和淋巴細胞浸潤，主要為CD3+、CD4+和CD8+淋巴細胞。部分小鼠還可觀察到嗜酸粒細胞浸潤和類似肉芽腫病變。此外，小鼠的膽管疾病可引起肝大甚至肝衰竭，若膽管阻塞還可導致腹水的形成［17］。

Schrumpf等［18］利用此模型衍生了GF(germ free)NOD.c3c4模型，發現膽管反應較輕，提示腸道微生物參與了疾病的發生，但腸道微生物對于疾病的作用仍需進一步探索。Mason［19］發現，抗反轉錄病毒可顯著改善NOD.c3c4小鼠的膽管炎，提示β反轉錄病毒與膽管炎的發展及線粒體抗體的產生有密切聯系。

NOD.c3c4小鼠模型在免疫學、血清學和病理等方面與PBC患者表現有類似之處，適合基因調控等方面的進一步研究。但與人類疾病仍有較大差別，其雌性優勢并不十分明顯，AMA產生率僅為60%左右，小鼠的病理主要為肝內多囊性病變［17］。

3.2 轉化生長因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)Ⅱ型受體顯性失活型小鼠模型 TGF－β對免疫穩態和耐受起著關鍵作用，異常的TGF－β信號分子可導致肝臟自身抗原的耐受性喪失，促進自身免疫疾病的發生。在CD4啟動子的控制和缺乏CD8沉默子的條件下，TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠可自發形成類似人類PBC的特征［20］，表明TGF－β參與了PBC的發病機制。

TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠在22～24周時自發產生AMA，且主要為IgA水平升高，IgM水平并沒有明顯升高。同時，小鼠血清IFN－α、TNF－β、IL－6和IL－12p40等細胞因子水平顯著升高。病理方面可觀察到匯管區出現中到重度淋巴細胞浸潤，以及特征性的單核/巨噬細胞浸潤。與PBC患者類似，TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠也發現CD8細胞總數和百分數均升高，CD4+/CD8+T細胞比值下降，并觀察到膽管損傷［21］。

研究者在該模型背景下通過基因敲除構建了新的小鼠模型，對研究趨化因子和免疫分子在發病中的機制，臨床藥物的優化發揮重要作用。Ma等［22］在該小鼠模型基礎上敲除CXC趨化因子受體3，發現其促進小鼠CD8+細胞的活化，導致自身免疫性膽管炎的加重;Tsuda等［23］在該模型基礎上建立了IL－12p35－/－和IL－12p40－/－小鼠模型，結果發現其肝臟炎癥嚴重程度與原模型相似但卻延遲發生;Moritok等［24］探索了新的人源化抗CD20 IgG1抗體對該模型的治療作用，發現其較抗人CD20的嵌合抗體改善效果更為明顯，提示藥物療效不佳的原因可能為體內存在抗藥物抗體，從而為臨床藥物的優化提供新思路。

TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠模型自發產生AMA且陽性率高，與PBC患者有相似的血清學特征，匯管區有淋巴細胞和單核細胞浸潤，膽管上皮破壞嚴重，可以很好地模擬人類疾病。但存在無雌性優勢，門靜脈區嗜酸粒細胞浸潤和肉芽腫形成并不明顯，IgA水平升高等與人類疾病不同之處。

3.3 人IL－2受體α敲除(interleukin－2 receptorα－/－，IL－2Rα－/－)小鼠模型 人IL－2Rα－/－小鼠模型血清學AMA陽性，IgG、IgA顯著增加，血清輔助性T細胞(helper T cell，Th)1細胞因子(TNF－α、IL－2、IL－12p40、IFN－γ)和Th2細胞因子(IL－6)水平顯著升高。病理肝臟匯管區有淋巴細胞和單核細胞中度浸潤，小葉間膽管細胞核不規則排列，扭曲的管腔和細胞脫離基膜，與PBC患者慢性非化膿性破壞性膽管炎表現相似。門靜脈浸潤大量的CD8+和CD4+細胞，且以CD8+細胞為主［25］。

近年來，IL－12被認為與PBC有密切聯系，如Yao等［26］構建的IL－12p40－/－IL－2Rα－/－小鼠模型表現出更嚴重的門靜脈炎癥和膽管損傷。為探索不同T細胞在PBC發病機制中的作用，Hsu等［27］構建了IL－2Rα－/－CD4－/－和IL－2Rα－/－CD8－/－模型，結果發現前者膽管損傷加重，結腸炎癥減輕，而后者相反，提示CD8+T細胞介導膽管損傷，CD4+T細胞介導結腸特異性免疫反應。

IL－2Rα－/－小鼠模型可以很好地模擬早期PBC的肝匯管區炎癥與膽小管破壞，產生的AMA可結合到自身抗原的內部硫辛酸結構域。但該模型年齡與性別無差異，也沒有肉芽腫和嗜酸粒細胞浸潤;此外還會合并其他自身免疫性疾病［25］，如溶血性貧血、急性結腸炎等，導致過早死亡，因此該模型并不是PBC的特異性模型。

3.4 Scurfy小鼠模型 調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)在自身免疫病中發揮抑制疾病的作用，而叉頭框蛋白3對Treg細胞的生長、穩定和功能非常重要。Scurfy小鼠是通過叉頭框蛋白p3基因突變，導致Treg細胞功能缺失而建立的小鼠模型［28］。

Scurfy小鼠模型可產生AMA，IgM、IgA及IFN－γ、IL－6、IL－12p40、IL－18和IL－10等細胞因子水平升高。病理出現PBC樣門靜脈炎癥和膽管損傷，小葉間膽管淋巴細胞浸潤和退行性病變，肝臟病理中可觀察到中性粒細胞、嗜酸粒細胞和組織細胞浸潤［28］。

Scurfy小鼠模型在血清學和病理上與PBC十分相似，對于進一步研究Treg細胞在疾病機制中的作用有重要意義。但該模型與人類疾病仍有許多不同之處［28］，如沒有產生肉芽腫，小鼠壽命極短，只有4周左右［29］，且雄性失去生育能力等。

3.5 陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)a，b－/－小鼠模型 AE2參與細胞內pH調節和經上皮酸堿轉運，刺激膽汁性碳酸氫鹽排泄，AE2損傷可致膽管上皮細胞損傷與對膽管炎誘導的凋亡敏感［30］，也可誘導自噬失調［31］使模型出現類似PBC的特征。

AE2a，b－/－小鼠模型大多產生了針對PDC－E2的AMA，血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶，以及IFN－γ和IL－12p70等細胞因子水平升高。該模型出現了膽汁淤積性肝損傷的表現，約90%出現了門靜脈炎癥，同時還出現輕微的纖維化和炎癥浸潤，浸潤細胞主要為單核細胞。損傷的膽管周圍出現CD4+T和CD8+T細胞，且以CD8+T細胞為主［29］。

AE2 a，b－/－小鼠模型在免疫和形態學上與PBC患者類似，均有AMA產生和一些細胞因子水平的升高，還出現了CD8+T細胞的增多和Treg細胞的減少，門靜脈區炎癥細胞浸潤。但該模型同時也存在無雌性優勢、實驗環境和實驗成本較高，且存在合并其他疾病和難以繁衍的問題［29］。

3.6 腺嘌呤尿嘧啶富含元件敲除(adenylate uridylaterich element del，ARE_Del－/－)小鼠模型 ARE_Del－/－小鼠模型是通過敲除IFN－γ基因3＇非翻譯區中具有162 nt的ARE而建立［32］。敲除ARE后導致IFN－γ的長期慢性表達，而IFN－γ可能在PBC啟動階段對膽管上皮細胞發揮致病作用。

ARE_Del－/－小鼠模型在8～10周時，即可檢測到AMA，血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶明顯升高，總膽汁酸升高;20周時，出現中到重度門靜脈淋巴浸潤，門靜脈和小葉炎癥，小膽管損傷和肉芽腫形成。小鼠膽管破壞與年齡有關，肝臟呈現輕度纖維化［33］。作為少有的具有雌性優勢的小鼠模型，推測與IFN信號有關。Bae等［33］發現，雌性小鼠Th1細胞介導的信號通路高度上調，提示可能與IFN－γ通過CD4+T細胞激活的Th1細胞反應有關。隨后他們將該模型與IFNⅠ型受體α鏈基因敲除小鼠雜交發現，ARE_Del－/－IFNⅠ型受體α鏈基因敲除小鼠的性別優勢消失，進一步證明了IFN信號與PBC雌性優勢相關［34］。

ARE_Del－/－小鼠模型體內出現針對PDC－E2等的自身抗體，膽管破壞與年齡有關，有明顯的雌性優勢。但門靜脈炎癥和肝實質炎癥主要由CD4+T細胞引起，與PBC患者的CD8+T細胞浸潤不同。此外，還存在肝纖維化程度較低、模型特異度不高等問題［34］。

4 聯合構建小鼠模型

針對化學誘導小鼠模型存在誘導時間過長與病理表現較輕的不足，Ambrosini等［35］將2－辛炔酸與聚肌胞苷酸兩種藥物進行聯合免疫實驗，發現與2－辛炔酸單獨免疫組相比，聯合免疫組血漿中的AMA水平并未增加，但血漿中的IFN－γ、TNF－α、IL－12p40和IL－6等細胞因子水平顯著升高;同時，聯合免疫小鼠肝臟中CD8+T細胞浸潤顯著增加。聯合免疫1周后，自然殺傷細胞的活性顯著增強。與單獨免疫小鼠相比，聯合免疫小鼠的表現更接近PBC患者，這可能由于聯合免疫小鼠在自身免疫耐受喪失的基礎上進行了二次打擊，更真實地模仿了人類疾病［35］。此外，除了不同化學誘導之間的聯合免疫，也有學者嘗試使用化學與生物誘導聯合免疫，但與單獨誘導小鼠相比，大腸埃希菌與聚肌胞苷酸聯合誘導小鼠在生物化學、組織學等方面并無明顯差異［36］。

5 小 結

PBC的病因及發病機制目前尚不明確，故很難通過動物模型來完全模擬PBC。大多數模型與人類疾病相比均存在模擬程度不足、病變較輕的缺陷。在實際應用中，需根據研究內容來選擇合適的動物模型。雖然基因修飾類小鼠模型在疾病發生機制中提供了許多新思路，但價格與壽命限制了其廣泛使用。藥物誘導小鼠是最常用的模型，但也存在造模時間過長、造模成本過高的問題。未來應在深入研究疾病機制的基礎上，構建新的小鼠模型，以更好地模擬疾病特征，同時兼顧時間與造模成本，不同造模方法之間的聯合可能是一個新思路。