循環腫瘤細胞檢測在鼻咽癌診療中的研究進展

鄧偉明，韋嘉章，李敏，瞿申紅

(1.廣西醫學科學院 廣西壯族自治區人民醫院耳鼻咽喉頭頸科，南寧 530021； 2.廣西醫科大學研究生院，南寧 530021)

傳統腫瘤疾病主要通過組織活檢和影像學檢查結果進行診斷。影像學檢查對微小瘤體診斷的準確率較低，只有當腫瘤直徑>5 mm時，影像學檢查才能發現，而瘤體直徑>1～2 mm時即開始有血管新生[1]。因此，影像學檢查具有顯著的滯后性。液體活檢技術的出現，為腫瘤的診斷與動態監測提供了新方法。液體活檢是指通過血液、尿液、腦脊液等體液檢測腫瘤的循環成分。在腫瘤形成和發展過程中，部分腫瘤細胞由原發灶或轉移灶脫落進入外周血液，因此這部分細胞又被稱為循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)。CTC檢測是近年新興的液體活檢的代表，與傳統組織病理活檢相比，CTC檢測具有便捷、無創、實時的優點[2-4]。目前，CTC檢測已廣泛用于腫瘤疾病的診斷和患者預后的評估。鼻咽癌是一種地理分布極不平衡的頭頸部惡性腫瘤，在我國南方尤其是粵語方言地區發病率較高，但在世界大部分地區卻十分罕見[5]。據統計，我國鼻咽癌平均發病率約為2.31/10萬，顯著高于世界平均水平(1.2/10萬)和東亞地區平均水平(1.8/10萬)[6]。由于缺乏特異性癥狀和有效的早期診斷方法，許多鼻咽癌患者就診時已處于疾病進展期。我國的鼻咽癌大部分為未分化非角化性癌，對放療較敏感。隨著放療技術的不斷發展，鼻咽癌患者的局部控制率與臨床預后均顯著改善，但仍有部分患者出現局部復發和遠處轉移，最終導致腫瘤相關性死亡。近年，隨著液體活檢技術的不斷發展完善，CTC檢測在腫瘤診療中的作用越來越受到關注[7-10]。現就CTC檢測在鼻咽癌診療中的研究進展予以綜述。

1 CTC特性

CTC以不同形態存在于外周血，既有單個細胞CTC，也存在CTC細胞簇(CTC≥3個細胞)，這些CTC細胞簇也被稱為循環腫瘤微栓子，在惡性腫瘤轉移中起重要作用，且循環腫瘤微栓子比CTC更具侵襲性、轉移潛能以及對凋亡的抵抗力[11-12]。與外周血中只有CTC的患者相比，外周血中出現循環腫瘤微栓子的腫瘤患者無進展生存期、總生存期均顯著縮短[13]。CTC具有不同的細胞表型，包括上皮細胞型CTC、上皮與間質細胞混合型CTC和間質細胞型CTC，細胞表型可反映腫瘤細胞的惡性程度，其中間質細胞型CTC較其他表型CTC具有更強的遷移和侵襲能力[14]。在腫瘤細胞增殖過程中，CTC可發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，主要表現為上皮細胞標志物(如上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白)下調和間質細胞標志物(如波形蛋白、螺旋蛋白)上調[15-16]。研究表明，在評估肝細胞癌的轉移以及確定治療方案時，檢測波形蛋白陽性的CTC較所有的CTC可能更具價值[17]。此外，EMT可協助CTC進入外周血液，使細胞獲得更強的侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移[18-19]。

2 CTC檢測技術

2.1CTC的富集 外周血中CTC的數量極少，平均每105～107個血細胞有1個CTC[20]，特別是在腫瘤早期，CTC的濃度更低。因此，敏感性高、特異性強的檢測分析方法對實現最大限度的CTC富集至關重要。根據CTC的生物學特性(蛋白質標志物的表達)和物理特性(大小、密度、可變形性等)，可以實現對CTC的分離和富集。

2.1.1膜過濾技術 與外周血細胞相比，CTC具有更大的核質比和體積[21]。膜過濾法是指利用CTC與外周血細胞體積的差異，通過8 μm孔徑的濾過膜分離血細胞，從而獲得CTC[22]。膜過濾技術操作簡單，具有便捷、高效、價廉等特點，且分離出的CTC不受其表面抗原上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白等影響[23]。血液中存在大小不等的CTC，部分體積較小的CTC能夠通過濾過膜，而體積較大的外周血細胞則無法通過濾過膜，因此易出現假陰性或假陽性結果。此外，即使濾過膜不堵塞，也很難完全從外周血中分離提取出高純度的CTC，因此膜過濾技術會影響CTC的純度。

2.1.2密度梯度離心技術 密度梯度離心技術是指利用細胞沉降系數的差異來分離細胞。根據斯托克斯定律，顆粒的沉降速率與顆粒的大小和密度成正比，同時與懸浮液的密度也成正比，因此，含有不同類型細胞的混合物經離心分離后，細胞會根據其自身密度以不同速率通過密度梯度，從而得到不同的分層區域[21]。基于外周血液中細胞密度的不同，在外周血中加入特定的分離液，經過離心后由下至上依次得到紅細胞、粒細胞、離心液和單核細胞，而CTC、血漿在最上層[24]。密度梯度離心法具有成本低、簡單可靠等優點，同時可保留CTC的活性。但在操作過程中混入了分離液會導致CTC部分損失；此外，部分白細胞與CTC密度接近，不易被清除，導致CTC純度較低。

2.1.3免疫磁珠富集技術 免疫磁珠富集法是將抗體與磁珠上的細胞表面抗原結合，形成特異抗原抗體復合物，然后通過磁場的吸附作用將CTC分離出來。根據細胞表達抗原的不同，免疫磁珠富集法可分為陽性分選和陰性分選[25]。陽性分選是針對上皮來源的腫瘤細胞標志物(如上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白)與連接有磁珠的特異性單抗結合，外加磁場吸附作用，從而分離出CTC。陽性分選依賴上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白等抗原的表達，腫瘤細胞在遷移過程中常發生EMT，而上皮細胞標志物丟失可導致CTC漏檢，出現假陰性結果[26]。陰性分選是利用外周血中表達的抗原(如CD45)與磁珠表面的抗體特異性結合，去除白細胞而富集CTC。陰性分選特異性高，可避免EMT的影響，因此臨床上多采用陰性分選技術進行CTC檢測，但缺點是捕獲到的CTC純度相對較低。

2.1.4CanPatrolTMCTC富集技術 CanPatrolTMCTC富集技術充分結合了免疫磁珠富集技術和膜過濾技術的特點，在濾過前，首先通過紅細胞裂解去除紅細胞，然后通過磁珠分離技術去除白細胞，最后將體積較大的CTC分離出來。CanPatrolTMCTC富集技術是一種基于過濾的方法，可提供單個CTC的形態學、免疫細胞學以及遺傳學的表征。收集到的CTC可以通過免疫熒光、熒光原位雜交和基于聚合酶鏈反應的遺傳分析進行鑒定。CanPatrolTMCTC富集技術的平均去白細胞效率為99.98%，CTC平均回收率不低于80%[27]；與單純的免疫磁珠富集技術相比，CanPatrolTMCTC富集技術CTC平均回收率提高約22%[28]。免疫磁珠技術和膜過濾技術兩者優化后的CanPatrolTMCTC富集技術靈敏度更高，可復性更好。

2.2CTC的鑒定 目前CTC的鑒定技術主要包括流式細胞技術、免疫熒光技術、聚合酶鏈反應技術以及熒光原位雜交技術等。流式細胞技術綜合單克隆抗體、免疫細胞化學、激光以及電子計算機技術等，使熒光標記的抗體與CTC表面抗原特異性結合，然后通過流式細胞儀快速定量分析CTC。流式細胞術精確度高、準確性好，但靈敏度差，成本高。免疫熒光技術是目前應用廣泛的CTC鑒定技術，其根據抗原抗體反應原理，借助細胞角蛋白、CD45等熒光抗體和熒光染料對CTC染色，然后在熒光顯微鏡下對染色的CTC進行分析鑒定。聚合酶鏈反應是一種靈敏度較高的鑒定技術，通過檢測腫瘤細胞信使RNA的表達水平鑒定CTC，但假陽性率較高，且細胞形態易受到破壞，不利于CTC的進一步使用。熒光原位雜交技術結合了分子生物學與細胞遺傳學的特征，利用熒光素標記的核酸探針對CTC進行鑒定，且具有較高的靈敏度和特異度。

3 CTC檢測在鼻咽癌診療中的應用

3.1早期診斷 鼻咽癌的早診斷、早治療是降低患者病死率、提高生存率的關鍵。目前，鼻咽癌的診斷大多依靠EB病毒血清學檢測及DNA分析或影像學檢查，組織病理學活檢仍是確診的金標準。EB病毒血清抗體標志物與血漿EB病毒DNA檢測均可用于鼻咽癌的早期篩查，但特異度不高。而影像學和病理學檢查也存在明顯的局限性。CTC在鼻咽癌各個階段的表達不同，因此檢測外周血中的CTC對鼻咽癌的早期篩查及診斷均具有積極作用[29]。毛燕嬌等[30]采用CanPatrolTMCTC富集技術分析49例鼻咽癌患者與20例正常人CTC的表達水平，結果發現，僅在鼻咽癌患者腫瘤細胞中檢測到CTC，而在正常人或非腫瘤細胞中并未檢測到CTC。該發現與吳君心等[31]、伍勇等[32]、蔡清清等[33]的研究結論一致。因此，CTC可作為鼻咽癌早期輔助診斷的標志物。

3.2輔助分期 TNM分期是影響鼻咽癌患者治療的重要因素。臨床上鼻咽癌的診斷和TNM分期主要依靠磁共振成像等影像學技術，但影像學具有遲滯性和不穩定性，不能及時評估鼻咽癌的療效。而CTC檢測不僅可彌補影像學和組織病理學的局限，還能反映腫瘤整體異質性的特征，特別是對于已經發生轉移或接受過治療的患者，CTC具有顯著優勢。Yu等[10]指出，鼻咽癌晚期(Ⅳ期)患者總CTC計數顯著高于鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者，其CTC中位數水平也高于鼻咽癌早期患者。Si等[34]應用CanPatrolTMCTC富集技術和經典原位雜交實驗分離、鑒定鼻咽癌患者的CTC，結果發現，CTC水平與鼻咽癌分期密切相關，且鼻咽癌患者總CTC計數、間質型CTC計數以及間質型CTC占總CTC的比例均與鼻咽癌的臨床分期呈正相關，而混合型CTC計數與鼻咽癌的臨床分期呈負相關。以上研究表明，CTC的分型檢測結果可以作為TNM分期的補充手段。然而，另一項關于CTC與頭頸部鱗狀細胞癌臨床特征的前瞻性研究顯示，CTC與頭頸部鱗狀細胞癌分期無相關性[35]。Li等[36]的研究結果也證實鼻咽癌患者CTC的陽性率與TNM分期無相關性。此外，He等[29]發現，CTC在鼻咽癌各分期均有表達，但與TNM分期無關。雖然鼻咽癌患者存在CTC，但CTC與TNM分期的相關性仍存在較大爭議。

3.3療效評價 臨床醫師可根據CTC檢測結果及時有效地調整治療方案，提高鼻咽癌患者的療效。有研究發現，鼻咽癌患者的CTC水平與療效具有一定相關性[36-37]。曾偉華等[38]利用抗體標記聯合流式細胞儀檢測60例晚期鼻咽癌患者的CTC水平，結果發現，與治療前相比，治療后3個月患者的CTC計數及陽性率均顯著降低，同時CTC陰性患者的緩解率顯著高于CTC陽性患者，差異有統計學意義。Zhang等[39]研究發現，經2～4個周期的化療后，鼻咽癌患者的CTC計數顯著降低，表明CTC數量變化與治療反應相關，治療后患者的CTC數量減少表明鼻咽癌患者獲得顯著療效。由此可見，CTC在評估鼻咽癌療效方面具有良好的應用價值。

3.4預后評估 復發或遠處轉移是腫瘤患者預后不良的重要指標，而腫瘤的復發及轉移均與CTC密切相關[40]。研究表明，CTC的存在與乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、肝癌、肺癌等患者的不良預后相關，而在腫瘤治療過程中CTC計數會發生改變，表明CTC可作為監測腫瘤患者預后的潛在指標[7，41-45]。也有報道指出，CTC是鼻咽癌患者預后不良的獨立危險因素，CTC計數增加表明晚期鼻咽癌患者的預后不良，且與EB病毒DNA檢測相比，CTC診斷遠處轉移的特異度顯著升高，而CTC聯合EB病毒DNA檢測還可提高臨床判斷鼻咽癌患者預后的準確率[46-47]。Wen等[48]研究證實，間質細胞型CTC與鼻咽癌患者無進展生存期顯著相關，化療后血液中未檢測到間質細胞型CTC的患者無進展生存期顯著延長，表明間質細胞型CTC可作為預測患者無進展生存期的重要指標。另有研究表明，鼻咽癌患者的CTC計數與轉移也具有相關性，發生轉移的鼻咽癌患者CTC平均計數顯著高于未轉移患者，且差異有統計學意義[49]。此外，Si等[34]研究發現，間質型CTC與鼻咽癌的轉移呈顯著正相關，尤其是淋巴結轉移，同時混合型CTC、間質型CTC占總CTC的比例也與鼻咽癌淋巴結轉移呈正相關。

3.5指導治療 腫瘤治療已進入個體化治療時代，基因檢測可為腫瘤治療提供最有利的信息，依據基因分子結構的特點，針對不同基因靶點選擇合適治療藥物，可以達到精準醫療的目的。血液中的CTC攜帶腫瘤的全部基因，通過監測鼻咽癌患者CTC的表型變化，有助于判斷CTC的侵襲性和轉移能力；同時，對CTC進行基因分析還可為臨床醫師提供更準確、更完整的信息，有利于鼻咽癌患者個體化治療的實施。Zhang等[39]監測12例鼻咽癌患者接受吉西他濱聯合順鉑化療后外周血中CTC核型的變化，結果發現，攜帶三倍體和多倍體CTC的患者較攜帶四倍體CTC的患者更易出現耐藥，表明CTC的核型分析可評價化療的敏感性與耐藥性，是鼻咽癌患者療效的重要預測因子。Fu等[50]研究表明，鼻咽癌患者外周血中人端粒酶逆轉錄酶信使RNA的表達與腫瘤浸潤范圍、淋巴轉移及遠處轉移均密切相關，而放化療可抑制人端粒酶逆轉錄酶基因的表達，因此檢測鼻咽癌患者CTC中人端粒酶逆轉錄酶信使RNA水平，可以為鼻咽癌患者的早期診斷、治療以及預后提供重要信息。可見，研究鼻咽癌患者外周血中CTC的基因表達對治療的選擇具有重要意義，但仍需更充分的證據驗證其應用價值。

4 小 結

CTC檢測技術是一種非侵襲性的生物分析方法，具有靈活、便捷、無創的優點。CTC檢測在腫瘤各治療階段均可進行，可實時監測腫瘤動態變化、精準地了解腫瘤的遺傳學信息，為腫瘤患者的個體化診療提供依據。目前CTC在鼻咽癌患者的臨床應用中已展現出良好的前景，但仍存在某些技術難題有待解決，如目前的技術尚不能同時兼顧高特異度與高靈敏度、對CTC陽性的判斷尚無統一標準等。因此，改進目前的CTC檢測技術，不僅有助于指導鼻咽癌的治療，還可改善患者的預后。相信隨著科學技術的進一步發展，未來CTC檢測技術會不斷完善，其臨床應用價值也將顯著提高。