miR-21對骨質疏松小鼠骨髓基質細胞增殖的影響

李雷 王峰 劉念 張長城 李剛 宋曉飛 劉瑜 王華磊 趙玉果 楊國志

南陽市中心醫院骨二科，河南 南陽 473000

骨質疏松癥是一種全身骨代謝疾病，絕經后婦女骨折發生與骨質疏松有關，單位體積骨量減少、骨組織微環境發生退化是其主要特征[1]。骨質疏松癥骨折不僅愈合緩慢而且愈合質量較差，畸形愈合風險較高。微小RNA(micro RNA，miRNA)是源于內源性轉錄物的單鏈非編碼RNA[2]，生物信息學分析發現37個miRNA與絕經后骨質疏松癥的某些核心疾病存在靶向作用[3]。骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是人體骨髓中具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞潛能的多能干細胞[4]，其增殖能力降低會誘導骨質疏松癥，雌性激素缺乏會引起BMSCs生物學特性改變，加重機體骨質疏松癥進程，但其中具體作用機制尚未完全闡明[5]。miR-21納米微局部注射可以促進骨折愈合生物活性[6]，但在絕經后婦女骨質疏松性骨折有關研究報道較少。本研究旨在探討miR-21對絕經后骨質疏松癥小鼠BMSCs增值能力與成骨能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、骨質疏松癥小鼠模型構建

將12只8周齡C57BL/6J雌性小鼠{南方醫科大學[SCXK(粵)2016-0041}參考文獻[7]進行雙側卵巢切除術(記為OVX組)，另選12只小鼠只切除卵巢周圍接近的脂肪組織、不摘除卵巢(記為Ctrl組)，剩余操作與OVX組一致，術后腹腔注射4×104U青霉素預防感染。所有小鼠均在SPF級動物飼養房(溫度22 ℃～24 ℃，濕度58%～57%，人工關照12 h/d)中連續飼養8周，Micro-CT掃描結果明確骨質疏松癥小鼠模型構建成功。

1.2 BMSCs分離、培養及純化

模型構建成功后，處死小鼠，α-MEM培養液(含10%血清)沖洗股骨、脛骨髓腔，移液器輕柔吹打均勻，800 r/min 5 min，棄上清，α-MEM培養液(含10%血清)重懸細胞，置于培養瓶在37 ℃、5% CO2加濕培養箱培養，細胞生長至培養瓶壁80%～90%，0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，再次傳代培養，取第3代細胞于后續實驗。

1.3 主要試劑和儀器

MTT Assay Kit(YB111105-500，Ybscience)，siPORT NeoFX 轉染劑(AM4510，美國Ambion公司)，α-MEM培養基(MEL07-6X500 ML，美國Caisson公司)，ant-miR-21和ant-miR-21 negative control、pre-miR-21和pre-miR-negative control(廣州銳博生物科技有限公司)，PCNA、Ki67、Runx2抗體(FNab06217、FNab09788、FNab07536，武漢菲恩生物科技有限公司)，Osterix抗體(bs-1110R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，茜素紅(I0013，上海寶曼生物科技有限公司)，堿性磷酸酶染色試劑盒(XY-44274-1，上海信裕生物科技有限公司)，堿性磷酸酶活性試劑盒(CK-E20105，武漢益普生物科技有限公司)，miRNA提取試劑盒(ZYB1803，上海澤葉生物科技有限公司)，miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)(KR211、FP411，天根生化科技有限公司)。

CO2細胞培養箱(Forma 3110，Thermo Fisher Scientific)，多功能酶標儀(SpectraMax iD3，美國Molecular Devices)，Micro-CT(80989787 日本hitachi-aloka)，7500 fast定量PCR儀器(100019，美國ABI公司)。

1.4 RT-PCR檢測

提取Ctrl組、OVX組BMSCs的miRNA，反轉錄合成cDNA并作為PCR擴增模板，95 ℃ 15 min、94 ℃ 20 s，60 ℃，34 s，42個循環，U6為內參基因，2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。重復3次。

1.5 miR-21轉染小鼠BMSCs

Ctrl組BMSCs分為2組，OVX組BMSCs分為4組，參考文獻[8]用siPORT NeoFX轉染pre-miR-negative control(pre-miR-NC)、ant-miR-negative control(ant-miR-NC)至Ctrl組BMSCs，記為Ctrl-pre-miR-NC、Ctrl-ant-miR-NC；將pre-miR-21、pre-miR-NC、ant-miR-21、ant-miR-NC至OVX組BMSCs分別記為OVX-pre-miR-21、OVX-pre-miR-NC、OVX-ant-miR-21、OVX-ant-miR-NC，培養條件同1.2，培養48 h，進行miR-21相對表達水平RT-PCR驗證。

1.6 MTT法檢測細胞增殖情況

取1.5中轉染所得BMSCs，調整細胞密度為2×104/mL，接種96孔板(100 μL/孔)，每組設置3個復孔，培養至24、48、72 h時，加入0.5 mg/mL MTT(100 μL/孔)，繼續培養4 h，棄上清液，加入DMSO(200 μL/孔)孵育0.5 h，多功能酶標儀波長570 nm檢測吸光值(A值)。重復3次。

1.7 BMSCs成骨誘導與茜素紅染色

取1.5中轉染所得BMSCs，生長融合達>70%時，培養液更換為成骨誘導液，誘導2周，茜素紅染色[9]、堿性磷酸酶(ALP)染色法[10]、ELISA法檢測BMSCs成骨能力和ALP活性。茜素紅染色：誘導結束后，棄成骨誘導液，4%多聚甲醛固定0.5 h，茜素紅染色0.5 h，PBS洗滌10 min，顯微鏡觀察；茜素紅染色定量：茜素紅染色后，加入CPC溶液，充分溶解，波長562 nm檢測光度值，茜素紅染色相對定量=實驗組光度值/對照組光度值。ALP染色：細胞固定同茜素紅染色，加400 μL ALP染液，室溫避光染色1 h，清水沖洗2次，晾干，顯微鏡觀察。ALP活性按照ELISA法試劑盒說明書操作。

1.8 Western-blotting檢測

提取1.5中BMSCs培養48 h細胞總蛋白，調整蛋白濃度、SDS-PAGE凝膠電泳、轉PVDF膜、密封2 h，加入PCNA、Ki67、Runx2、Osterix、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，加入HRP標記二抗(1∶500)孵育1 h，顯色，凝膠成像系統自帶軟件分析條帶灰度相對值。重復3次。

1.9 統計學分析

使用GraphPad Prism、SPSS 22.0軟件，數據以均值±標準差表示，多組間用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 骨質疏松小鼠BMSCs中miR-21表達水平

VOX組骨質疏松小鼠BMSCs中miR-21表達水平低于Ctrl組(P<0.05)(圖1)。

圖1 骨質疏松小鼠BMSCs中miR-21表達水平Fig.1 Expression level of miR-21 in BMSCs of osteoporosis mice注：與Ctrl組比較，*P<0.05。

2.2 miR-21轉染骨質疏松小鼠BMSCs驗證

OVX-pre-miR-21組BMSCs中miR-21相對表達水平高于OVX-pre-miR-NC組(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組BMSCs中miR-21相對表達水平低于Ctrl-pre-miR-NC組(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組BMSCs中miR-21相對表達水平低于OVX-ant-miR-NC組(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組BMSCs中miR-21相對表達水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖2)。

圖2 miR-21轉染骨質疏松小鼠BMSCs驗證A：miR-21高表達驗證，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；B：miR-21低表達驗證，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.2 Verification of BMSCs transfected with miR-21 in osteoporosis miceA: Verification of high expression of miR-21, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; B: Verification of low expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-ant-Mir-NC group; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.3 miR-21對骨質疏松小鼠BMSCs增殖的影響

OVX-pre-miR-21組細胞增殖、PCNA、Ki67水平高于OVX-pre-miR-NC組與Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組細胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-pre-miR-NC(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組細胞增殖、PCNA、Ki67水平低于OVX-ant-miR-NC組與Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組細胞增殖、PCNA、Ki67水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖3)。

圖3 miR-21對骨質疏松小鼠BMSCs增殖的影響A：miR-21高表達下BMSCs細胞增殖情況(24、48、72 h)；B：miR-21低表達BMSCs細胞增殖情況(24、48、72 h)；C：miR-21高表達下BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝膠成像結果；D：miR-21低表達下小鼠BMSCs(48 h)PCNA、Ki-67凝膠成像結果；E：C圖蛋白水平統計結果；與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05，與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；F：D圖蛋白水平統計結果；與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.3 The effect of miR-21 on the proliferation of BMSCs in osteoporosis miceA: Proliferation of BMSCs cells under high expression of miR-21 (24, 48, 72 h); B: Proliferation of BMSCs with low expression of miR-21 (24, 48 and 72 h); C: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with highly expressed miR-21. D: The imaging results of BMSCs (48 h) of PCNA and Ki-67 gel with lowly expressed miR-21. E: Figure C statistical results of protein levels; Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05, compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; F: Fig. D statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

2.4 miR-21對骨質疏松小鼠BMSCs成骨能力的影響

OVX-pre-miR-21組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平高于OVX-pre-miR-NC組(P<0.05)，OVX-pre-miR-NC組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-pre-miR-NC組(P<0.05)；OVX-ant-miR-21組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于OVX-ant-miR-NC組與Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)，OVX-ant-miR-NC組ALP染色程度和活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平低于Ctrl-ant-miR-NC(P<0.05)(圖4～6)。

圖4 各組骨質疏松小鼠BMSCs ALP染色結果A：各組骨質疏松小鼠BMSCs ALP染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC組，b：OVX-pre-miR-NC組，c：OVX- pre-miR-21組，d：Ctrl-ant-miR-NC組，e：OVX-ant-miR-NC組，f：OVX-ant-miR-21組；B：miR-21高表達下BMSCs ALP活性，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；C：miR-21低表達下BMSCs ALP活性，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.4 ALP staining results of BMSCs in each groupA: BMSCs and ALP staining of osteoporosis mice in each group(×200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: ALP activity of BMSCs under high expression of miR-21, *P<0.05 compared with Ctrl-pre-Mir-NC group; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: ALP activity of BMSCs under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

3 討論

骨質疏松癥是指因骨量減低與骨組織的微結構發生變化引起的骨骼強度下降、脆性增強疾病，女性絕經后，雌性激素缺乏可加速骨吸收，導致骨組織微結構發生改變。BMSCs在特定的條件下可以分化為成骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞等，BMSCs分化成骨細胞分化受多種因素影響。miR-141-3p可靶向抑制基質細胞衍生因子-1(SDF-1)表達抑制小鼠BMSCs成骨轉化[11]。miR-21在雌性激素缺乏狀態下可以促進小鼠BMSCs成骨分化[12]，本研究發現骨質疏松小鼠BMSCs miR-21表達水平降低，miR-21高表達可以提高BMSCs細胞增殖、PCNA、Ki67水平，miR-21低表達呈反向趨勢。PCNA是可促進DNA延伸與合成的核蛋白，對激活細胞增殖具有重要意義。Ki67是與細胞增殖相關的細胞核抗原， 可調節細胞的有絲分裂，說明miR-21高表達可以增強骨質疏松癥小鼠BMSCs細胞增殖能力。

圖5 各組骨質疏松小鼠BMSCs茜素紅染色結果A：各組骨質疏松小鼠BMSCs 茜素紅染色(×200)，a：Ctrl-pre-miR-NC組，b：OVX-pre-miR-NC組，c：OVX- pre-miR-21組，d：Ctrl-ant-miR-NC組，e：OVX-ant-miR-NC組，f：OVX-ant-miR-21組；B：miR-21高表達下茜素紅相對定量，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；C：miR-21低表達下茜素紅相對定量，與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.5 Alizarin red staining results of BMSCs in each groupA: Alizarin red staining of BMSCs of osteoporosis mice in each group(× 200), a: Ctrl-pre-Mir-NC group, B: OVX-pre-Mir-NC group, C: OVX-pre-miR-21 group, D: Ctrl-ant-Mir-NC group, e: OVX-ant-Mir-NC group, F: OVX-ant-miR-21 group; B: The relative quantification of Alizarin red under high expression of miR-21. Compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05; C: The relative quantification of Alizarin red under low expression of miR-21, compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

圖6 各組骨質疏松小鼠BMSCs Runx2、Osterix水平A：miR-21高表達下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝膠成像結果；B：miR-21低表達下BMSCs(48 h)Runx2、Osterix凝膠成像結果；C：A圖蛋白水平統計結果，與Ctrl-pre-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-pre-miR-NC組比較，#P<0.05；D：B圖蛋白水平統計結果；與Ctrl-ant-miR-NC組比較，*P<0.05；與OVX-ant-miR-NC組比較，#P<0.05Fig.6 Runx2 and Osterix levels of BMSCs in each groupA：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under high expression of miR-21；B：Imaging results of BMSCs (48 h) Runx2 and Osterix gel under low expression of miR-21；C：Figure A statistical results of protein level, compared with Ctrl-pre-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-pre-Mir-NC group, #P<0.05；D：Figure B statistical results of protein level; Compared with Ctrl-ant-Mir-NC group, *P<0.05; Compared with OVX-ant-Mir-NC group, #P<0.05

miR-21缺乏會降低骨形成速率，延長骨形成時間，可通過影響細胞增殖與遷移能力來調節骨吸收與破骨細胞生成能力。本研究發現miR-21高表達可以提高BMSCs細胞ALP染色程度、ALP活性、茜素紅染色程度、Runx2、Osterix水平，miR-21低表達呈反向趨勢。Runx2是早期成骨細胞分化的骨質基因表達啟動子，其表達降低可抑制成骨形成[13]。Osterix是成骨分化的重要的含鋅指結構的轉錄因子，位于Runx2下游，參與成骨細胞分化途徑調控過程。miR-21可通過上調PI3K/Akt信號途徑促進BMSCs遷移，miR-21表達水平升高可促進大鼠BMSCs增殖、侵襲及分化并修復心臟損傷[14]，但也有研究[15]認為miR-21可促進豬外周血干細胞成脂分化。本研究結果與前人部分研究結果相似，認為miR-21表達水平升高可以促進骨質疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化，與某些研究結果一致，可能與物種種類或BMSCs提取部位有關。

綜上所述，miR-21表達水平升高可促進骨質疏松小鼠BMSCs增殖、成骨分化能力，可能與調節PCNA、Ki67、Runx2、Osterix水平有關，但其中具體作用機制還需要深入研究。