馬鈴薯莖段和葉片再生體系建立

張冬梅，修志君，馮亞艷，楊春芳，王麗瑋，劉 潔，張笑宇

（1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010020；2.包頭市園林綠化事業發展中心，內蒙古 包頭 014000）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是一年生草本植物，是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物［1］.我國作為世界馬鈴薯生產第一大國，隨著馬鈴薯產業的快速發展，急需特色、優質的新品種［2］.傳統育種方法，很難達到產量、品質和抗性的大幅度提高［3］，以改良基因、創造新品種為戰略目標的植物基因工程技術越來越受重視，使馬鈴薯基因的遺傳改良和育種工作取得質的飛躍，為培育馬鈴薯新品種提供了可能［4-5］.

植物基因工程中，組織培養再生是遺傳轉化體系的建立、突變體的篩選、優良種苗的快速繁殖及體細胞雜交等技術的前提和基礎［5］.馬鈴薯再生體系要經過愈傷組織的誘導和分化過程，易受基因型［6-7］、外植體種類［8］、植物激素種類及濃度［9-10］影響，同時光照時間、溫度等外界環境因素也會不同程度地影響愈傷組織形成及其再分化［11-12］.馬鈴薯組織培養再生是一個十分復雜的過程，沒有可普遍應用的再生體系，不同馬鈴薯品種遺傳轉化之前都要先建立相應的再生體系［13］，再生體系對農桿菌介導的有效遺傳操作和獲得穩定表達的轉基因株系均具有重要的理論和實踐意義.目前存在馬鈴薯的再生誘導率低、質量不穩定、試驗重復性差等問題［8］，因此，對于馬鈴薯的愈傷組織誘導及再生體系還需進一步優化.

筆者以大西洋脫毒試管苗為試驗材料，對其莖段和葉片的再生體系進行研究，篩選愈傷組織形成及芽誘導培養基，優化最佳激素配方，以期獲得高效愈傷組織誘導率和分化率的培養體系，為建立大西洋再生體系和馬鈴薯遺傳轉化體系奠定理論基礎，為馬鈴薯的基因工程育種、品種改良、基因功能研究提供技術基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯材料為培養28 d生長良好的大西洋（Atlantic）脫毒試管苗，是經莖尖剝離、病毒檢測的無毒組培苗，保存在內蒙古農業大學園藝與植物保護學院植物病理實驗室.

供試培養基為Murashige and Skoog（MS）培養基：硝酸鉀（KNO3）1.9 g，硝酸銨（NH4NO3）1.65 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.17 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.37 g，無水氯化鈣（CaCl2）0.332 g；碘化鉀（KI）0.008 3 g，硼酸（H3BO3）0.062 g，硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.223 g，硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）0.086 g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）0.002 5 g，硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.002 5 g，氯化鈷（CoCl2）0.000 25 g；乙二胺四乙酸二鈉0.037 3 g，硫酸亞鐵0.278 g；肌醇10 g，甘氨酸0.02 g，鹽酸硫胺素0.001 g，鹽酸吡哆醇0.005 g，煙酸VB5或VPP 0.005 g，蔗糖30 g·L-1，瓊脂8 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8~6.0.

試驗試劑：6-芐氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、赤霉素（GA3）均購于北京索萊寶科技有限公司；玉米素（ZT）購自北京百靈威科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 試管苗擴繁

將帶腋芽的莖段接種于MS培養基進行擴繁，培養條件為溫度23～25 ℃，光照時間為16/8 h，光照強度為2 000~3 000 lx.3～4周苗齡的試管苗用于試驗.

1.2.2 誘導愈傷組織形成的培養基篩選

1.2.2.1 誘導愈傷組織形成的培養基制作

配制不同濃度的激素：0.25、1.50、2.50、5.00 mg·L-16-BA和0.10、0.20、0.30、0.40 mg·L-1NAA，用無菌0.22 μm過濾器過濾除菌，分裝于50 mL滅菌離心管中，4 ℃保存.經高壓滅菌后的MS培養基冷卻到50 ℃左右時，按表1中的配比加入激素，制成不同激素濃度的培養基.

表1 愈傷組織誘導培養基Tab. 1 Callus induction medium mg·L-1

續表1

1.2.2.2 試驗設計

無菌操作剪取0.5~1.0 cm長不帶腋芽和葉片的培養好的大西洋脫毒試管苗莖段及切掉部分葉尖保留葉柄的健壯葉片.將莖段和葉片分別移入配制好的各種誘導愈傷組織形成的培養基中.1個培養皿中放置莖段20個、葉片15個，試驗設3次重復，按1.2.1中的培養條件培養14 d，根據愈傷組織生長情況統計愈傷組織誘導率.

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的莖段或葉片/莖段或葉片總數×100%

1.2.3 不定芽分化培養基篩選

1.2.3.1 不定芽分化培養基的制備

配制不同濃度激素：1.00、2.00、3.00、5.00 mg·L-16-BA，0.05、0.10、0.20、0.30 mg·L-1NAA，0、1.00、2.00、3.00 mg·L-1ZT和0、2.50、5.00、10.00 mg·L-1GA3，用無菌0.22 μm過濾器過濾除菌，分裝于50 mL滅菌離心管中，4 ℃保存.經高壓滅菌后的MS培養基冷卻到50 ℃左右時，按表2中的配比加入激素，制成不同激素濃度的芽分化培養基.

1.2.3.2 試驗設計

將在C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）和C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）培養基中形成的莖段和葉片愈傷組織再分別移入不同激素濃度的不定芽分化培養基（表2）中，試驗設3個重復，按1.2.1中的培養條件培養，觀察芽分化情況，40 d統計芽分化率.

表2 不定芽分化培養基配比Tab. 2 Ratio of adventitious bud differentiation medium mg·L-1

芽分化率=分化出不定芽莖段或葉片/莖段或葉片總數×100%

1.2.4 數據統計

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0對數據進行統計和分析，在0.05水平上進行差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對大西洋愈傷組織形成的影響

將莖段或葉片接到愈傷組織誘導培養基上，生長7 d左右時，莖段兩端切口處開始膨大變粗，并逐漸向中部擴展；葉片切割邊緣慢慢卷曲，開始出現膨大增殖現象，葉柄的傷口處也逐漸膨大.生長至14 d左右時，葉片、葉柄及莖端切口處均會長出肉眼可見的愈傷組織（圖1）.

圖1 最佳培養基對愈傷組織的誘導培養（14 d）Fig. 1 The best medium for callus induction culture（14 d）

不同激素配比的16 種培養基對莖段愈傷組織的誘導結果表明，莖段在C1（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA）、C2（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA）、C3（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）、C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）、C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C16（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）這6種培養基上的愈傷組織誘導率均在90%以上，生長量較好，淡綠色，米粒狀（表3）.通過試驗發現，在C3和C4培養基上已生根，而在其他培養基上則無生根.由此可知，誘導莖段愈傷組織最佳培養基為C4.

不同培養基對葉片愈傷組織的誘導結果表明，在愈傷組織誘導率、組織量、顏色和形狀等方面，葉片在C2（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA）、C3（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）這3個培養基上的愈傷組織誘導率最低，均在45%以下，愈傷組織生長量較差，愈傷組織呈乳白色，小突起；在C13（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA）、C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C16（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）培養基中的誘導率分別為85.93%、77.04%和80.74%，生長量最好，淡綠色，米粒狀（表3）.通過試驗發現，雖然葉片在C13和C16培養基上的誘導率均大于C15，但在C13和C16培養基上無生根，而C15培養基上已生根.因此，葉片愈傷誘導的最佳培養基為C15.

表3 不同激素配比對大西洋莖段和葉片愈傷組織誘導Tab. 3 The effect of different hormone ratios on Atlantic stem and leaf callus induction

2.2 不同激素配比對大西洋愈傷組織不定芽分化的影響

將莖段和葉片愈傷組織轉到以6-BA、NAA、ZT 及GA3組合配比的16 個分化培養基上，觀察結果表明，生長3周左右開始形成綠色芽點，5周左右慢慢長出肉眼可見的小芽（圖2）.

圖2 不同培養時間的莖段不定芽分化Fig. 2 Adventitious bud differentiation of stem at different culture time

比較不同培養基上莖段愈傷組織不定芽分化率和長勢，最佳培養基為D14（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3），分化率為41.11%，芽多且粗壯；其次為D5（MS+2.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+5.00 mg·L-1GA3），分化率為31.11%，芽多且粗壯；其他培養基上的分化率較低，長勢較差；在D1（1.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA）培養基上生長最差，分化率為6.11%，芽弱小（表4）.

比較葉片愈傷組織不定芽分化率和長勢，最佳培養基為D14（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3），分化率為40.00%，芽多且肥厚；其次是D7（MS+2.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT）和D15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT）培養基，分化率均為30.37%；其他培養基較差；最差的是D1（1.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA）培養基，葉片愈傷組織基本不分化成芽，只出現愈傷組織增大且老化現象（表4）.

表4 不同激素配比對大西洋莖段和葉片不定芽誘導Tab. 4 Different hormone ratios on adventitious bud induction in Atlantic stem segments and leaves

總之，誘導莖段和葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養基均為D14，其分化率均達40%.

3 討論與結論

適宜的外植體應具備幼年型、增殖能力強、再生能力強及遺傳穩定性好的特點.目前，不帶腋芽的莖段［14］、葉片［15］或試管薯［16］作為馬鈴薯外植體用于再生體系研究中，幼苗的苗齡［17］、接種方式［18］和培養條件［19-20］均對馬鈴薯的再生有一定影響.激素的種類和濃度是影響馬鈴薯愈傷組織形成的關鍵因素.馬鈴薯愈傷組織形成只有在合適配比的細胞分裂素和生長素類激素的組合中才可以取得較好的誘導效果［21］.本試驗中選用不同濃度的6-BA和NAA激素組合配比對莖段和葉片的愈傷組織進行誘導，莖段誘導最佳培養基為MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA，葉片誘導的最佳培養基為MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA，其誘導率分別為96.67%、77.04%，愈傷組織為淡綠色，結構較致密呈米粒狀，且均可生根，結果與張之為等［22］研究一致.不同激素濃度對愈傷組織形成有很多影響.本試驗研究發現，6-BA濃度為0.25 mg·L-1和5.00 mg·L-1時，莖段愈傷組織形成情況差別不大，但使用0.25 mg·L-16-BA配合0.40 mg·L-1NAA進行誘導時，會促進莖段愈傷組織的根生長.楊明賀等［13］研究得出不一致的結果，認為6-BA的最適濃度為2.00 mg·L-1，降低或者升高，莖段愈傷組織誘導率均大幅度下降.

不同濃度的激素對馬鈴薯莖段和葉片的愈傷組織不定芽分化存在影響.已有研究表明，GA3是提高愈傷組織不定芽分化階段的關鍵激素，可促進莖的伸長生長，促進細胞分裂和分化［23-24］.本試驗結果顯示，誘導莖段和葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養基均為MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3，其誘導率均可達40%.張之為等［22］利用MS+2.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT可使大西洋的愈傷組織分化出芽，分化率為18.18%，這和本試驗的結論一致，不加GA3激素，適當添加ZT激素，也會促使愈傷組織的不定芽分化.