氣腫疽梭菌免疫學檢測方法概述

張文璇 曲庭偉 方 程 金 鑫,2* 嚴昌國

1.延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉133000；2.東北寒區肉牛科技創新教育部工程研究中心/延邊大學，吉林延吉133002；3.延邊大學農學院動物科學系，吉林延吉133000

民間俗稱的黑腿病即氣腫疽的別名之一，該病由氣腫疽梭菌引起，常見的典型臨床癥狀為發病動物肌肉豐滿部位發炎、腫脹，觸壓可聽到類似捻發音[1]。發病急促，潛伏期短，病情發展迅速，許多動物無可見癥狀即死亡[2]。該病主要通過患病的牛進行傳播，其具體經過是患病牛在草場采食放牧期間污染土壤或經過集約化養殖的飼料與飲水進行傳播。健康的牛采食被污染的食物后，病菌可以進入消化道，繼而發生感染。另外，氣腫疽梭菌的芽孢能在土壤中存活相當長的一段時間，成為持久的傳染源[3]。本病一年四季均有可能發生，在氣溫高且濕度低的夏季更為多見，在地方性流行方面也呈現一定的特點，如在地勢相對低洼的地區該病更易發生。

作為梭狀芽胞桿菌屬的一員，氣腫疽屬于專性厭氧菌。其菌體的長度為1.5～8.5 μm，菌體兩端圓滑，無莢膜，因其有周身鞭毛而能夠運動，芽胞通常位于菌體中央，也有可能偏向其中一端[4]。一般來說，37 ℃即接近動物的體溫，對于氣腫疽梭菌而言是最適宜生長的溫度。在血瓊脂培養基上培養，可見菌落呈現圓形、顏色一般為半透明，中心略微隆起，邊緣不整齊，有β 溶血環，但一般情況下現象不明顯[5]。

在對該病進行檢測時，較為常用的手段多是以其流行病學特點、臨床癥狀表現及呈現的病理特征來做出判斷。被感染的動物通常發病迅速，甚至有的病例無可見癥狀即死亡。臨床上患病動物體溫升高，可達42 ℃[6]。有伴發敗血癥的機率，呈現全身癥狀，肌肉豐厚的部位腫脹、發炎。若病變部位位于肩部或后肢，則常出現行動障礙。患病動物通常會在1～3 d 內死亡，尸體腐敗速度快，天然孔可見暗紅發黑血液流出，通常呈現為泡沫樣[7]。取肌肉做切面，也呈黑紅色。

該病主要危害牛羊等反芻動物[8]，但近幾年也有人被感染的病例，這使得該病又一次成為各國各地相關人員關心的研究熱點。在對該病進行診斷時，需注意該病與炭疽和惡性水腫的臨床癥狀均有一定的相似之處，應鑒別診斷。

1 間接ELISA

ELISA 即酶聯免疫吸附劑測定，是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應的定性和定量的檢測方法。該方法自建立以來，就以其操作簡單、反應迅速、敏感性高等優點被廣泛應用于各項實驗室檢測。間接ELISA 原理為利用酶標記的抗體以檢測與固相抗原結合的受檢抗體[9]。該方法是對多成分進行分析，尤其需要注意對其組成成分進行嚴格控制，否則將會對結果造成相當大的影響。

車達等[10]于2011年首次成功構建了氣腫疽間接ELISA 檢測方法，通過超聲波對菌體進行破碎，將裂解后的氣腫疽梭菌菌體作為抗原，設立梯度稀釋度，并最終確定在質量濃度為50 μg/mL、酶標二抗稀釋度為1∶2 000 的條件下效果最佳，成功建立了病原菌的酶聯免疫吸附試驗。該方法簡便快捷，不但針對性強，而且在重復試驗中也有較好的表現。

2 Dot-ELISA

斑點酶聯免疫吸附試驗是一種用纖維素膜代替酶固體載體法的反應板的免疫分析方法，該方法彌補了涂層薄弱、易失效、樣品少、節省材料等缺點[11]，原理和ELISA 很相似。抗原吸附在纖維素膜上，與抗原-抗體酶標反應，形成抗原-抗體復合物，同時保持其免疫活性。該配合物能夠在酶的參與下顯示染色結果，檢測結果可以通過染色的色深來判斷。

姜永越[12]成功從氣腫疽梭菌C54-1 標準株中提取有效抗原，純化后用特異性最強的抗原免疫豚鼠。免疫4 次后，血清稀釋1 000 倍，用ELISA 檢測其OD 150 nm 值達1.6 以上。Dot-ELISA 的重復性試驗表明，血清具有特異性和穩定性，可作為氣腫疽梭菌的雙抗體夾心Dot-ELISA 檢測方法。當以1∶1 024 稀釋抗體時，抗原最小含量為3.15 μg，分泌抗原最小含量為1.89 μg，酶標二抗的最佳濃度為1∶4 000，可以檢測到微量氣腫疽梭菌毒素。

3 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體的一種新型免疫標記技術[13]。該技術具有制備簡便、標記簡單、特異性強、敏感性高、定位準確、適應性廣等特點，且膠體金試紙保存方便，無需任何復雜的儀器設備，可憑肉眼判斷結果。該技術的進步能夠極大地方便各種疾病在現場的快速檢測，因此在近些年得到了飛速的發展。

任春宇等[14]參考了免疫層析法的技術，選取氣腫疽梭菌標準株，制備氣腫疽梭菌單克隆抗體，并根據抗原-抗體的特性將單克隆抗體與膠體金標記結合，建立了不需要再加入任何檢測試劑且快速簡便的檢測方法，成功研制出了膠體金免疫層析試紙條，可在短時間內對氣腫疽做出準確診斷。該方法與ELISA 檢測相比，反應更為快捷，也呈現出了更強的特異性，當抗原量≥1×105CFU/mL 時，即可檢測成功，且有較好的穩定性。

4 小 結

自20 世紀以來，氣腫疽在國內20 多個地區的暴發給我國畜牧業發展帶來了嚴重的經濟損失[15]。對于氣腫疽這種病程短、發病急、危害嚴重的傳染性疾病而言，及時鑒別和快速診斷是極為重要的控制手段。因此，需要加強對該病的研究，采用分子生物學和免疫學的手段，一方面加快對新型疫苗的研制，另一方面要建立更加簡便有效的檢測方法。只有這樣才能更好地控制氣腫疽的傳播和蔓延，將該病帶來的損失降到最小。

以上列出的3 種免疫學檢測方法各有優勢與局限性，需要針對實際需求、臨床操作條件以及試驗環境[16]選擇符合條件的病原體檢測方法進行疾病診斷。另外，也有相當多的分子生物學檢測手段可以加以利用，因此，必要時也可以同時采用免疫學和分子生物學檢測方法進行判斷，以確保診斷無誤。