腹瀉犢牛大腸埃希菌的分離鑒定與藥敏試驗

張 成

山東省鄒平市長山鎮畜牧獸醫站，山東濱州256207

犢牛大腸桿菌性腹瀉為一類獸醫臨床中較為常見的疾病，半月以內的新生犢牛為發生此病的主要群體，春冬季為好發季節，死亡率高、發病急、病程短。依照犢牛的具體臨床表現可分為3 個類型，即腸炎型、腸毒血型和敗血型。如果未能及時對犢牛開展治療，數日內即可死亡。

很多犢牛于10～14日齡后發生疾病，患病后體溫會升高到40～41 ℃，24 h 后會排出膠凍樣黃色糞便，內部含有大量血絲以及黏液。在病期延長時，病畜可繼發性出現腕關節和副關節腫大，有的病畜還會表現出肺炎以及支氣管炎的癥狀[1]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗選擇2020年3月25日某養殖場內發病犢牛尸體組織為病原來源，取其淋巴結、脾臟、肝臟、心臟組織以及血液。

2）培養基種類為生化鑒定培養基、鮮血平板、三糖鐵瓊脂培養基、SS 培養基與LB 以及麥康凱培養基。

3）生化試劑種類：革蘭氏染色劑中包含碘片、濃度為95%乙醇、結晶分析純化學試劑、草酸銨、堿性復紅以及碘化鉀。

4）生化鑒定試劑：硫化氫、無水乙醇、甲基紅、氫氧化鉀、硫酸鈉、硫化亞鐵、α-萘酚、靛基質、蔗糖、甘露醇、麥芽乳糖以及葡萄糖。

5）藥敏試驗：藥敏紙片具體為土霉素、恩諾沙星、硫酸鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等。

6）試驗動物：10 只雄性小白鼠，體重為18～20 g。

1.2 研究方法

1）流行病學調查。工作人員全面探究飼養場當前管理情況、消毒情況、當地天氣、疾病具體發病過程、犢牛死亡情況、發病情況、具體癥狀以及解剖學病理改變，目的在于深度了解疾病的發生特點。

2）病料具體采集過程以及鏡檢過程。依照無菌操作原則，收集病牛尸體淋巴結、脾臟、肝臟、心血組織，同時完成涂片工作。在此之后實施染色以及鏡檢。

3）大腸埃希菌分離以及培養。將以上組織分別接種在LB 肉湯內實現培養，環境溫度為37 ℃，接種時間為24 h，然后實施革蘭氏染色與鏡檢觀察。

4）大腸埃希菌純化。開展細菌分離培養工作，把脾臟、肝臟等組織分別接種在新鮮兔血營養瓊脂平板中，每類臟器接種平板為4 份。其中，2 份實施普通需氧菌培養，另外2 份實施厭氧菌培養，將其放入溫度為37 ℃的恒溫箱中24 h 查看結果。針對于分離出的細菌開展革蘭氏染色與鏡檢，然后將細菌進行純培養，將純培養物接種在麥康凱培養基、三鐵斜面穿刺培養基以及LB 培養基內，于37 ℃環境下需氧培養24 h，在此之后查看最終結果。

5）生化鑒定步驟。糖分解試驗：取用分離菌24 h純培養物，接種在麥芽甘露醇培養基、乳糖培養基、葡萄糖培養基中，培養處理24 h，溫度為37 ℃，查看結果。MR/VP 試驗過程擇取分離菌培養物，將其接種到葡萄糖蛋白胨水溶液內，培養處理24～48 h，溫度為37 ℃，并在其中添加指示劑[2]。

6）硝酸鹽還原。試驗取用分離純培養物質接種到硝酸鹽培養基內，培養處理24 h，環境溫度為37 ℃，加入試劑乙以及試劑甲。如果在0.5 min 內轉為紅色，即可視為陽性；如果沒有顏色，則應增加少量鋅粒，若出現紅色為陰性試驗。

7）藥敏試驗。本試驗應用藥敏紙片法開展藥敏試驗工作，常用種類為四環素類以及青霉素類藥物。

8）動物試驗。本試驗實施動物致病性試驗，將分離取得的大腸桿菌接種自營養肉湯內，培養10 h，溫度環境設定為37 ℃。取用培養液接種試驗動物，同時設立對照組。

9）溶血試驗。本試驗應用平板法對分離溶血的特性加以測定，工作人員把大腸桿菌菌種接種到濃度為5% LB 平板內培養處理48 h，溫度設定為37 ℃，查看溶血情況，若菌落四周出現溶血圈，則判定為陽性結果。

2 結果與分析

通過開展動物試驗病原菌分離鑒定試驗，觀察病理改變、查看臨床癥狀以及實施流行病調查，結果表明：該養殖場內犢牛死亡原因為大腸桿菌感染所致。

經藥敏試驗結果證實：大腸桿菌菌株針對于各類藥物敏感性存在較大差異。其對于慶大霉素以及硫酸鏈霉素敏感性強，對于四環素以及新霉素耐藥[3]。

3 討 論

當前，學術界已確定共計3 類大腸桿菌會導致犢牛腹瀉。

1）產熱較為穩定或者熱不穩定的腸毒素大腸桿菌，其也被稱為產腸毒素性大腸桿菌。

2）大腸桿菌定植于小腸黏膜，但不會生成復雜腸毒素。上述菌株能以特異性的方式吸附于動物腸腔表面腸細胞中，常于杯狀凹陷內或者胞漿突起之上。大腸埃希菌吸附于腸上皮表面，經常引發微絨毛脫落。學術界將此類病變稱之為吸附脫落病理改變。

3）大腸桿菌定植于動物大腸表面所引發的輕微痢疾，這種情況也會導致AE 病變。上述菌株會引發大腸出血，所以其也被稱為腸出血性大腸桿菌。某些腸出血性大腸桿菌和腸致病性大腸桿菌會產生一類毒素，能夠消滅體外培養的Vero 細胞，其可被稱為類志賀毒素或者Vero 細胞毒素。這種毒素不會引發AE病變，但會參加到相關致病過程中。

如果犢牛便內帶血，尤其是便內無分離的沙門氏菌以及隱孢子蟲狀況下，若發現大腸以及小腸黏膜有關大腸桿菌，就可以推斷其為腸致病性大腸桿菌。

本組試驗結果表明：該養殖場內犢牛死亡原因為大腸桿菌感染所致。藥敏試驗結果證實：菌株對于慶大霉素以及硫酸鏈霉素敏感性強，對四環素和新霉素耐藥，出現這一情況的原因和長期盲目用藥有關。基于此，建議相關人員在治療犢牛大腸桿菌病過程中，有必要定期輪換用藥，最好是先實施藥敏試驗，擇取敏感藥物開展有效治療，以免造成經濟損失。

要想預防此類疾病發生，務必要做好綜合化防治舉措，降低各類應激因素出現率。強化對于牛犢的飼養管理力度，做好牛舍通風，落實各項衛生保健舉措。另外值得說明的是，飼養主也有必要增加清洗犢牛飲奶器具的頻次。