HPLC法測定鹽酸莫西沙星中R—異構體含量研究

孫江峰 董艷華 張小軍

揚子江藥業集團江蘇海慈生物藥業有限公司 江蘇 泰州 225300

引言

鹽酸莫西沙星是臨床上常用的一種抗菌藥物，有抗菌譜廣、抗菌能力強、半衰期長、療效好、副作用小及和其他抗菌藥物之間不會形成交叉耐藥性等特征，當下在國內實現商品化的有鹽酸莫西沙星片、膠囊及注射液，多用于治療成人呼吸道感染，也作為糖尿病、腎損傷患者的一種輔助性藥物。從結構層面上分析，鹽酸莫西沙星的分子內存有2個手性中心，有學者預測其可能存有4種異構體，4S、7S構型是當下臨床準許應用的異構體，但制造階段可能會引進少許的其他異構體，故而精準分離異構體與采用適宜的檢查方法是很有現實意義的[1]。本文采用HPLC手性流動相添加劑法拆分異構體，檢測相應的含量值。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀（LC-2010C HT型），其內含有LCSolution色譜工作站。

鹽酸莫西沙星對照品I（批號：Y 0 0 0 0 7 0 3，純度達99.906%），R-異構體對照品II（批號：20110726，純度99.820%）與原藥（批號20110612、20110620與20110703）；硫酸銅；L-苯丙氨酸；選用蒸餾水、甲醇分別作為超純水、色譜純。

2 操作方法與結果分析

2.1 配制溶液

對照品II貯備液：準確稱取10㎎對照品II，將其安置在10ml容量瓶內，添加流動相溶解并定容處理，便能配制出1㎎/ml對照品II貯備液[2]。

供試品溶液：取10㎎原藥，置于10ml瓶中，操作方法同上制得1㎎/ml的供試品溶液。

2.2 色譜條件和適用性試驗

Zorbax SB-C18色譜柱（4.5mm×150mm，5μm）；流動相：手性流動相添加劑溶液（750㎎硫酸銅+991.3㎎ L- 苯丙氨酸，添加適量蒸餾水溶解并定容到1L）—甲醇（39:11），流速1.0mL/min，柱溫45℃，檢測波長293nm；進樣量10μL。

量取對照品I、II適量，添加流動相溶解并稀釋制備成含有I 1㎎/ml、II 2μg/ml混合液，將其作為系統適用性試驗用溶液。量取適量對照品II，溶解、稀釋制得1μg/ml溶液。取以上兩種溶液作為系統適用性溶液（含有異構體0.5%左右）。稱量10μL以上系統適用性溶液，將其輸注至液相色譜儀內，R-異構體和莫西沙星的留存時間分別是13.8min、16.6min，兩者的分離度是3,.4，基于R-異構體峰進行計量，理論塔板數是4296。

2.3 線性關系分析

稱取適量的莫西沙星R—異構體對照品，精準定容，添加溶劑溶解并稀釋制得0. 55、1.10、2.20、2.75、5. 50μg/ml的系列溶液。準確量取以上系列溶液各10 μL，依次將其輸注至液相色譜儀內，記錄相應的色譜圖。將峰面積（A：μV×s）、濃度（C：μg/ml）分別設定為縱、橫坐標，以此為據進行線性回歸分析，獲得如下的線性方程：A=3. 926×105C-1. 566×105 r=0. 9995線性范疇是0.55～5.40μg/ml。

2.4 加樣回收率試驗

稱取莫西沙星原藥（批號20110612 其內R-異構體含量0.24%），大概24mg，精準稱定，共計8份，依次將其置在50ml量瓶內，精確投用“系統適用性試驗”下的R-異構體儲備液0.5、1.0、1.5mL各3份，添加溶劑溶解并稀釋到設計刻度，混合充分搖均，將其設定成異

構體回收率試驗中的測試液。取適量測試液與R—異構體對照品各10μL，按序注入值液相色譜儀內，依照峰面積，利用外標法測算出回收率。統計結果發現，低、中、高濃度回收率（n=3）依次是98.3%、99.7%、99.6%；RSD依次是0.68%、0.92%、0.83%，平均回收率（n=8)達到了99.3%。

2.5 檢測限與定量限

取適量R—異構體對照品溶液，適當稀釋處理，進樣檢測。當信噪比（S/N）達到3時，檢測得到R—異構體的檢測限是1. 1 ng；當信噪比（S/N）是10時，檢測出R—異構體的定量限是3. 5ng[3]。

2.6 進樣精密度試驗

取適量R—異構體對照品溶液，持續進樣6次，檢測R—異構體的峰面積，RSD（n=6）是0.29%。

2.7 溶液穩定性試驗

稱取原藥（批號20110620）25㎎左右，精準定容，將其安置于50 mL量瓶內，添加適量溶解（超聲波助溶）并稀釋到設計刻度，搖勻，將其作為供試品溶液（0.5㎎/mL），考察分析溶液的穩定性。室溫條件下分別安置0h、1h、2h、4h、6h、8h 以后分別進樣10μL，記錄相應的色譜圖，其R—異構體峰面積的RSD（n=6）對應值是0.94%，提示在室溫條件下本溶液持續放置8h內，依然能維持自身性質的相對穩定性。

2.8 重復性試驗

量取相同批次試樣（批號20110703），精準量取、定容，添加事前準備好的溶劑進行溶解及稀釋處理，配制出濃度大概為0.5㎎/ml的6份供試品溶液，分別規范的檢測R—異構體含量。通過結果發現R—異構體含量平均值（n=6）s 0.24%,RSD是2.6%，提示本課題研究中采用的HPLC法重復性優良。

2.9 測定R—異構體

即稱取適量莫西沙星原藥，添加試劑溶解及稀釋處理，配制成濃度大概0.5㎎/ml供試品溶液，精準稱取以上溶液及R—異構體對照品溶液各10μL，分別進樣檢測，形成的色譜圖見圖1，4頻次樣品內R—異構體含量依次是0.16%、0.24%、0.16%/0.27%。

3 討論

3.1 選擇與優化色譜條件

手性流動相添加劑法應用時把某種手性金屬離子的配位體添加到色譜洗脫劑內，于某種非手性固定相之上拆分對映體。該種方法在確保分離度與較短分析時間的基礎上，優化了配位離子Cu2+與手性配位體L-苯丙氨酸的濃度。流動相內甲醇的比例是影響留存時間與分離度的主要因素之一，當甲醇占比達到22%時，耗用的分析時間較短，并且分離度能符合設計要求。

3.2 溶劑的選擇

先嘗試用甲醇-水作為溶劑，分離度（R=2.3）與柱效（對照品I與II理論板數均在5000之上）都較好，但對照品II的進樣精密度偏大（RSD3.7%， n=5），回收率偏高（平均值127.4%），很難滿足定量分析的要求；當溶劑調換成內含手性添加劑的流動相時，能取得較理想的分析結果，確保測量結果有較好的重現性。

3.3 檢測濃度的選擇

參照最低檢出濃度要求，應用“上推法”去確定供試品溶液濃度，本品的最低檢出濃度0.11μg/ml，供試品溶液濃度應達到最低檢出濃度的2000`5000倍。故而選擇0.5㎎/ml供試液濃度作為測試濃度，在該濃度條件下，0.05%及以上的R-異構體都能檢出（信噪比＞6）。