骨組織工程3D生物打印的研究進展*

李博鈺 孟 丹

由于顱面結構的復雜解剖，顱面組織從創傷、手術切除或先天性畸形中完全恢復是極具挑戰性的［1］。而作為金標準的自體骨移植也由于其外形難以與受區匹配，存在一定的局限性。在近幾十年來，骨組織工程（bone tissue engineering, BTE）快速發展。骨組織工程的三個主要研究內容分別是骨組織工程三維多孔支架、骨種子細胞和生長因子［2］。其中支架的材料與制造是研究的重點，它需要適合細胞的生長繁殖并在結構上能夠使再生的組織成熟并行使功能。

3D生物打印（3D bioprinting, 3DBP）源于3D打印，通過逐層打印由生物材料和（或）細胞以及生物因子組成的生物墨水（bioinks），以高分辨率制造載有細胞的結構［3,4］。相比于3D打印，理想的3D生物打印可以更好地控制細胞和生物因子在支架中的分布，從而更利于組織再生，但目前也面臨著許多挑戰，比如可打印性、機械性能、血管化等［5］。隨著3D生物打印技術和材料學的不斷發展，研究者們致力于通過改進生物打印的參數和發現更合適的材料以解決現存的挑戰。本文將概述骨組織工程的3D生物打印及其研究進展。

1.骨組織工程

骨組織工程作為一個十分有前景的研究方向，通過結合生物活性分子、細胞和生物材料來構建仿生支架來恢復病變或受損的骨組織［6］。傳統意義上的骨組織工程是將種子細胞接種于支架上后進行培養。傳統的骨組織工程支架制備方法包括溶液澆鑄/離子洗出法、原位成型法、靜電紡絲法、相分離/凍干法、氣體成孔法等［7］，雖然用這些工藝制備出的支架進行骨組織工程取得了一定的成果，但研究者們的要求并不止于此。

首先傳統的支架制備方法是減法制造，即從整塊的材料中去除部分材料以得到目標結構［7］。但這類方法控制幾何形狀的能力有限，無法實現對支架材料和孔隙結構的精確控制，結構形狀也無法與骨缺損部位完全契合，不能實現個性化植入物的制備［8］。另外，這種在體外制造支架后再接種種子細胞的方法屬于無細胞支架制造技術，無法精準控制細胞的分布，無法保證所需的細胞密度、細胞鋪展、粘附、遷移和體內外相互作用［9］。

2.3D生物打印

隨著增材制造（additive manufacturing,AM）——也稱作3D打印——的出現，其逐層打印的方式克服了傳統支架制造方法在結構復雜性和空間異質性上的限制。而3D生物打印則克服了支架制造-細胞接種方法的弊端，將細胞在打印過程中直接封裝在支架內，即同時將生物材料和細胞沉積到設計的位置。其高通量制造和對細胞的精準控制［10］，在近十年來備受關注。

2.1 3D生物打印技術 目前可以有效地在骨支架內沉積和分布細胞的3D生物打印技術有基于噴墨的生物打印［11］、基于光的生物打印［12］、基于擠出的生物打印［13,6］。

2.1.1 基于噴墨的生物打印 基于噴墨的生物打印（inkjet-based bioprinting, IBP）通過熱、壓電或聲產生的力將液滴噴射到控制臺上，由于其高速、高通量、高精度且低成本的特點使其應用廣泛［14］。但它的缺點是生物墨水必須呈液態且呈低粘度，否則易堵塞噴嘴。這限制了生物墨水的細胞密度。而且液滴噴出后固化的延遲限制了垂直方向上（z軸）的分辨率［15,16］。

2.1.2 基于光的生物打印 基于光的生物打印（light-based bioprinting, LBP）是所有打印技術中速度最快、最精確的技術，且不受材料粘度的限制，包括激光輔助打印（laser-assisted printing，LAP）和立體光刻（stereolithography，SLA）［15］。前者是一種基于激光誘導前向轉移（laser-induced forward transfer，LIFT）的無噴嘴技術，它利于打印二維結構（例如皮膚），但最近的一些研究發現可以用這種方法制造復雜的3D結構［9,15］。后者利用光（紫外線或可見光）逐層選擇性地固化液態的光固化材料，擁有非常好的形狀保真度。激光打印的優點是高分辨率、可以打印復雜結構和高粘度（高細胞密度）材料，但光對組織的損害以及高成本是它的缺點［15］。

2.1.3 基于擠出的生物打印 基于擠出的生物打印（extrusion-based bioprinting）是最常用于骨組織工程的3D生物打印技術［4］，通過氣動或機械驅動將連續的生物墨水流以設定的速度和量從噴嘴中擠出到工作臺上［3,17］。它可以打印的生物材料范圍十分廣泛，包括水凝膠、共聚物和球形細胞團。但它主要的缺點是剪切應力、細胞聚集和沉淀會導致細胞活力下降。生物墨水的流變性（粘度）、打印速度（流速）等因素都會影響細胞所受的剪切應力。通過改善打印參數（流速、打印噴嘴的形狀和長度等）、尋找適當的生物打印窗口（biofabrication window）——即在打印性能和細胞活力之間權衡——研究材料的熱交聯和剪切稀化的能力，可以優化此打印技術［3,18-20］。另一個問題是分辨率低，100μm為最佳分辨率，但是特別適用于高粘度、高細胞密度的生物墨水［21-23］。

2.2 生物墨水 生物墨水（bioinks）是3D生物打印的重要環節，也是近十幾年來的研究熱點［4］。生物墨水被裝載在打印機料筒中（EBP和IBP），經由打印噴嘴將其放置在設計的位置后固化，或在打印平臺上，由光/激光固化（LBP）。它可以由一種或多種天然或合成生物材料制成，也可以由沒有任何其他生物材料的細胞聚集體制成［4,8］。本文僅討論含細胞的生物墨水。用于骨組織工程的生物墨水中封裝的細胞常用的有人骨髓間充質細胞（hMSCs）、人脂肪間充質干細胞（hASCs）、前成骨細胞、人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）等，與無細胞支架制造技術應用的接種細胞種類大體一致。理想的載細胞生物墨水有以下要求：（1）具有良好的生物相容性，能夠模仿天然組織的微環境，并可生物降解；（2）可打印性：具有良好的流變特性，且在打印后有良好的形狀保真度；（3）具有足夠的機械強度，且與目標組織相匹配；（4）保持細胞活力，且促進細胞分化；（5）可定位功能性生物因子（例如血管內皮生長因子VEGF）以利于植入后封裝細胞的活性和新生組織向內生長［4,24］。

確定最佳的載細胞生物墨水配方是成功生物打印的關鍵步驟，到目前為止，各種具有特定特征的天然和合成生物材料已經被用作生物墨水［4］。常用的生物材料主要是水凝膠類，還可將其與多種材料結合組成復合材料。

2.2.1 水凝膠 水凝膠有著很好的生物相容性、可降解性和保水性。多數還有利于細胞粘附、增殖、分化的細胞結合位點［4］。水凝膠可以分為天然水凝膠和合成水凝膠。已用于骨組織工程的天然水凝膠包括海藻酸鹽（alginate, Alg）、殼聚糖（chitosan, CS）、明膠（gelatin, Gel）、膠原、絲蛋白（silk fibroin, SF）和透明質酸（HAc）等，后者包括甲基丙烯酸化明膠（GelMA）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDMA）、Pluronic F-127等［4,15,25］。水凝膠可通過熱、離子、酶促和光交聯。高溫可能會對細胞造成不可逆的損傷，然而有研究已經證明周圍環境溫度上升4-10℃，2μs內不會對細胞產生致命損傷［26］，熱會在細胞膜上造成瞬時的孔，但會在打印后2h內修復，且孔有利于基因和大顆粒的遞送［27］。蛋白質類的水凝膠多用酶促交聯，這種方法的優點是較溫和；CaCl2是最常用的海藻酸鹽離子交聯劑［6］。對于離子交聯和酶促交聯來說，如果在打印過程中交聯，則需要共擠出生物墨水和交聯劑，或依次沉積兩種組分；若在打印后交聯，則需要多種交聯機制的混合物［28］。例如Chen等［29］用雙交聯的方式，先后用轉谷酰胺酶TG交聯明膠并用Ca2+溶液交聯藻酸鹽，制備了藻酸鹽/明膠水凝膠的互穿聚合物網絡（interpenetrating polymer network，IPN），提高了構建體的結構完整性。

2.2.2 復合材料 復合材料結合了每種組分的優點，在機械強度、可打印性、生物相容性和凝膠化特性方面有所提升［15］。例如海藻酸鹽雖然有高吸水性、生物相容性和生物降解性，但它是一種相對生物惰性的材料，缺乏細胞粘附配體。但通過對其進行修飾，例如將RGD肽偶聯到海藻酸鹽上以產生細胞結合位點［4］。

納米粒子（nanoparticles）由于量子效應和較大的表面積對體積比，具有各種尺寸、形態和表面修飾的納米材料具有獨特的物理、機械、光學、化學和生物特性，可以用來修飾支架的性能，比如機械性能、骨傳導、骨誘導和骨整合性能，還可以用于藥物傳遞［30,31］。納米羥基磷灰石（nHA）可以以粉末或涂層的形式與殼聚糖、膠原、海藻酸鹽、明膠等材料復合［31,32］。Gao等人［33］將含hMSCs的PEGDMA材料與nHA用熱噴墨技術共打印，發現HA可顯著刺激hMSCs的成骨分化以及成骨ECM的產生，PEG-nHA組中膠原蛋白的產生最多，堿性磷酸酶的活性最高。Miina等人［34］在明膠-海藻酸鹽生物墨水中加入木質纖維素納米纖絲（wood-based cellulose nanofibrils，CNF）和生物活性玻璃（BG），發現BG有刺激早期成骨作用，但生物墨水的粘度也隨之增加導致剪切應力增加，細胞活力下降，加入CNF后依賴其剪切稀化特性降低粘度，改善流變性，提高了可打印性。G.Cidonio等人［35］將帶靜電的納米硅酸鹽（nSi）加入到納米處理離子共價纏結（nanoengineered ionic covalent entanglement，NICE）生物墨水中，共價交聯的彈性GelMA和離子交聯的脆性κ卡拉膠（κCA）通過應力分散提高了機械強度和粘度，nSi與前兩者形成非共價靜電鍵，提高了剪切稀化能力，且在轉錄組學水平誘導成骨分化。碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）［36］是石墨空心管狀結構，由通過sp2鍵連接的碳原子片制成，具有出色的電學性能和較高的機械和化學穩定性［30］，可以改善支架的機械性能［37］。雖然它有一定的細胞毒性，但有研究用CNT和明膠、海藻酸鹽做混合材料打印血管結構時發現少量（0.5%，w/v%）應用對細胞毒性很小［38］。納米纖維素由模仿膠原纖維網的納米纖維組成，含水量高，具有良好的機械強度和剪切稀化能力［3］，如上文研究［34］中所述可以改善生物墨水的可打印性。硅酸鎂鋰（Laponite，LPN）是一種合成納米黏土，可以與蛋白質相互作用，刺激成骨作用；改善生物墨水的機械強度，提高生物墨水的粘度和尺寸穩定性；改變流變特性，剪切稀化能力［24,39］。Yang-Hee等人［24］將LPN與GelMA結合形成復合生物墨水，hBMSC活力在LPN-GelMA中培養21d沒有顯著變化且能觀察到增殖，而hBMSC活力在GelMA中顯著下降。載hBMSC的LPN-GelMA支架中有礦化結節形成，且LPN-GelMA-VEGF支架顯示出比GelMA-VEGF更好的血管穿透性。Zhao等人［40］用羧甲基殼聚糖（CMCh）和無定形磷酸鈣（ACP）制成復合納米顆粒水凝膠支架。ACP相比于磷酸三鈣（TCP）和HA來說有更好的骨傳導性和生物降解性，但高度不穩定，故利用殼聚糖的陰離子衍生物CMCh穩定ACP 納米顆粒。該支架顯著增強骨形成蛋白-9（BMP-9）誘導的體內骨形成的效率和成熟度，同時抑制長期異位成骨中發生的骨吸收。

2.2.3 生長因子 還可以根據需求在水凝膠中添加相應的生長因子，例如骨誘導劑地塞米松、骨形態發生蛋白BMP、骨形成肽BFP-1，血管生成誘導劑VEGF等［35,37］。Luo等人［41］研究了雙肽負載的海藻酸鹽基水凝膠系統。因海藻酸鹽不含細胞粘附配體，故用整合素結合配體（RGD肽）與海藻酸鹽聚合物鏈偶聯，增強細胞活力并促進細胞增殖。當細胞擴增后，載有BFP-1的中孔二氧化硅納米粒子（MSN）pep@MSNs 釋放BFP-1，誘導hMSC 成骨分化。雖然生長因子如BFP-1、BMP-2可以刺激成骨，但半衰期短，很快被血液清除。如果要實現生長因子在缺損部位的高濃度持續刺激，同時避免大劑量使用的副作用（水腫、神經刺激等），可以通過（1）轉運載體中BMP-2蛋白的物理結合或捕獲來控制釋放；（2）運用基于基因轉導的細胞基因工程［42,43］。例如將BMP-2封裝在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微粒［42］或殼聚糖微球中［37］，能持續釋放BMP-2超過30d；或用明膠水凝膠［42］捕獲BMP-2，也可以持續釋放BMP-2。殼聚糖這種天然陽離子聚合物可作為DNA質粒的有效載體，轉染外源基因到人體細胞中［37］，Zeng等人［44,52］將含有BMP-4和血管內皮生長因子受體（VEGFR1）基因的重組質粒與殼聚糖制備成納米顆粒，植入骨缺損兔子中，與對照組相比骨缺損修復速度更快，新生骨質更多。Lin等人［42］將BMP-2慢病毒載體轉導的hBMSCs封裝于明膠水凝膠中，用基于可見光的立體光刻技術打印了支架。體內外實驗中都表現出較直接加入BMP-2的對照組更有效地保持BMP-2濃度和生物活性，促進更快更有效的骨形成（成骨基因的表達以及成骨的體積及質量均有顯著性差異）。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO），是一種含多種官能團的芳香烴，尺寸通常在納米至數微米。Goeun等人［45］在3w/v%的海藻酸鹽中混合0.5mg/mL GO，提高了生物墨水的可打印性、結構穩定性、成骨誘導性。

3.研究進展

3D生物打印骨組織工程支架一直以來的挑戰是水凝膠機械強度不足以及血管化［7,15］。機械強度可以通過上述復合材料的方式增強，也有學者通過制造生物陶瓷-載細胞水凝膠雙相支架構建支架［46,47］，初步解決了這個問題。

在過去的20年里，人們一致認為重建能保證穩定灌注的多級血管網對于成功建造大多數復雜組織是十分重要的［48,49］。一直以來骨組織工程面臨的挑戰就是構建體的血管化。大型結構的構建存在幾何結構復雜、組成多樣以及血管化的限制。雖然在幾何復雜性方面取得了重大進展，多組分結構也可以通過多噴嘴打印解決，但血管化的問題仍然困擾著研究者們，如同組織工程中的圣杯［50,51］。盡管通過單純地摻入VEGF等因子可以一定程度上促進血管生成，但是還是需要研發一些特殊的打印方法如結構仿生、時空控制釋放生物活性因子等，以完成復雜且互相連通的血管網絡的形成。Irene等人［52］用順序誘導法，先打印明膠-nHA支架，接種hMSC后先后在生長培養基（GM）和成骨培養基（OM）中培養1周和2周，獲得含有預分化的hMSC的支架，再將含有HUVEC：hMSC為4∶1的GelMA-纖維蛋白水凝膠填充到支架的大孔中，光交聯后在含或不含成骨培養基的內皮培養基中培養2周。發現在有良好的骨生成的同時成功地誘導了穩定的復雜且互連的毛細血管網絡形成。水凝膠中未分化的hMSC作為周細胞穩定了脈管系統。Takahisa等人［53］通過兩步式數字光處理（digital light processing，DLP）技術，先在外圍打印含磷酸八鈣（OCP）的GelMA環模仿骨皮質，之后在中央打印包含HUVEC球體的GelMA環模仿骨髓空間。HUVEC可以在GelMA水凝膠中形成3D毛細管網絡。植入缺損部位后，均勻地嵌在GelMA中的OCP刺激間充質干細胞的成骨細胞分化，預血管化將促進骨組織修復，血管化后宿主中遷移的MSCs或前成骨細胞可在OCP 的影響下分化為成骨細胞。Charlotte等人［54］用裝載兩種——成骨（MSC）和血管源性（大鼠主動脈內皮細胞）——獨立的細胞群的纖維蛋白生物墨水與PCL共打印制備3D生物打印雙相類骨支架。纖維蛋白具有誘導血管生成并促進細胞附著和增殖以及體外促進成骨的潛力，但是缺乏機械強度。機械強度高且多孔的基質PCL與纖維蛋白水凝膠共打印，降低了降解速率，維持長時間的機械穩定性，允許新的骨骼形成。體內外實驗中均體現出更好的成骨能力和血管生成能力。Batzaya等人［55］用基于擠出的生物打印制造了包含可灌注血管腔的微結構類骨組織構建體。該構建體由28個圓柱體組成一個三棱柱，中央的一個圓柱體由裝載HUVECs和hMSCs的低質量分數GelMA（GelMALOW）的生物墨水打印，打印外圍圓柱體的生物墨水由裝載hMSCs的共價結合VEGF的高質量分數GelMA（GelMAHIGH）組成，同時含有nSi以誘導hMSCs的成骨分化，VEGF的濃度從內到外逐漸增高。GelMALOW較GelMAHIGH降解速率高，體外培養12天后內芯降解留下開放的管腔和500μm的可灌注通道，HUVECs和hMSCs遷移到該通道的內表面，可灌注通道充當中央血管；構建體外圍的nSi以及成骨培養基的持續灌注誘導了的hMSC分化為骨組織。在體外研究中觀察到了毛細血管狀網絡形成。

4.總結與展望

盡管3D打印在過去的幾十年里已經發展得較為成熟，但可以在高溫、高壓力等條件下進行的3D打印的難度無法與載細胞的3D生物打印相提并論。3D生物打印皮膚、肝臟等組織器官已經成功設計并植入人體內，但骨組織工程的3D生物打印由于其對機械強度的要求尚處于起步階段且僅限于實驗室內，距離臨床應用還有很長的路要走。

目前3D生物打印已經走向骨組織工程的商業化和最終進展階段，盡管該領域取得了顯著的進步，但為復雜的組織制造設計合適的生物墨水仍然是一個長期的挑戰。其中3D生物打印技術已經形成較為成熟的體系，這一方面的改進是通過優化打印參數，在兼顧細胞相容性的同時提高可打印性；而對生物墨水和打印方法的創新是探索同時滿足機械強度和良好的細胞相容性以及血管化這兩個主要方面。載細胞打印將生物墨水限定于水凝膠，通過結合多種新型材料、生物因子以改善機械性能、可打印性、細胞活力、成骨能力和血管化能力。而對打印方法的改進多數基于對天然骨小梁和（或）血管結構的模仿，結合水凝膠與其他聚合物打印雙相甚至支架，在空間上制造生物因子濃度梯度，誘導支架在成熟過程中形成目標組織。

對于骨組織工程的一大難題——血管化——也已經有了許多新思路，通過順序誘導或多相材料共同培養等方法模仿天然的復雜骨結構。甚至可以將時間概念與3D生物打印結合，也就是4D生物打印，通過研發刺激響應型水凝膠，在3D生物打印過程結束后可以自發地在各種刺激下改變其特性，更順應體內微環境［23,36,56,57］。但目前仍處于實驗室階段，距離實際應用還有一定距離。在不遠的將來，我們仍需要更多研究來實現將具有良好血管化能力的3D生物打印骨組織工程支架應用到臨床。