SOD1突變及其介導的線粒體異常在肌萎縮側索硬化癥中的研究進展

羅紅梅，陳紅

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種多致病性神經退行性疾病，同時累計上下運動神經元，最終導致嚴重的肌無力與呼吸衰竭，從發病至死亡僅經2～5年[1]。ALS普遍分為散發性ALS(sALS)與家族性ALS(fALS)，sALS占90%，剩余10%的fALS與50多個基因相關[2-3]。其中銅鋅超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，SOD1)，C9orf72中的突變，肉瘤融合基因，TAR DNA結合蛋白43(TAR DNA binding protein 43，TDP-43)和其他一些病例占fALS的50%～70%，并且相同突變也出現在sALS病例中。因此，基因研究對我們了解該病的病理機制非常重要。目前，該病潛在的病理機制并未完全研究透徹，但現已知引起ALS的病因包括：谷氨酸介導的興奮性毒性、氧化應激、線粒體功能障礙、RNA信號異常、軸突運輸障礙等。目前批準用于臨床的藥物有利魯唑[4]和依達拉奉[5]，然而都沒有達到令人滿意的效果[6]。在此，我們回顧了SOD1的突變以及其對周圍環境產生的影響，描述了突變SOD1如何介導線粒體功能障礙導致ALS，并考慮針對突變SOD1介導的病理機制是否能夠研發新的藥物來阻斷其致病途徑，有效延緩疾病發展。

1 SOD1的正常生理作用與突變產生的影響

SOD1是一種抗氧化劑[7]，存在于細胞質、線粒體的膜間空間、過氧化物酶體、真核生物的細胞外空間以及某些原核生物的周質中[8]。早期文獻報道SOD1是由兩個相互作用強的亞基組成的二聚體，兩亞基由二硫鍵連接，整個SOD1蛋白具有豐富的β折疊，并與銅離子、鋅離子結合，起著將高反應性活性氧—超氧化物轉換為氧分子和過氧化氫的重要作用[9-11]。ALS患者體內編碼SOD1的基因發生突變，錯誤折疊的突變型SOD1會在脊髓的運動神經元中積累，產生的細胞毒性使運動神經元變性死亡。目前已知人類SOD1相關突變有180多種[12]，盡管人們一直在做研究，但ALS的根本原因仍然是個未解之謎。

正常SOD1為了成熟為活性酶，在二硫鍵還原，未完成金屬化的狀態下進入線粒體膜間隙(intermembrane space，IMS)，隨后在銅分子伴侶(copper chaperone for SOD1，CCS)的催化下進行翻譯后修飾：鋅和銅的插入，分子內二硫鍵的形成和二聚化，成熟的SOD1得以保留在IMS中[13]。活性氧(reactive oxygen species， ROS)由細胞正常代謝產生，是線粒體呼吸鏈復合物中發生電子轉移反應的旁路產物(主要是復合物I和復合物III)[14]。功能成熟的SOD1將超氧陰離子歧化為H2O2，后者再被過氧化氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶或過氧環氧酶進一步還原為H2O[15]。在線粒體應激條件下，SOD1活性的顯著提高可能導致IMS 中ROS和H2O2產生增加，H2O2被細胞色素C催化生成高反應性氧化劑oxoferryl-CytC(CytCFe 4+)，引起線粒體功能障礙，從而啟動細胞凋亡途徑[16]。而經實驗證明SOD1 G93A小鼠的脊髓IMS制劑的SOD1活性是野生型小鼠的6倍，說明SOD1突變后歧化酶活性增加以及ROS產生升高[17]。

2 突變SOD1介導的線粒體異常

線粒體在細胞代謝與存活方面發揮著重要作用。線粒體除了能夠產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為細胞供能之外，在磷脂的生物發生，鈣穩態和細胞凋亡中也起著重要的作用。線粒體腫脹與液泡化是ALS運動神經元中最早觀察到的病理特征之一[18]，在ALS發作之前已經觀察到突變SOD1在線粒體中積累[19]，這是運動神經元變性的標志之一。目前普遍認為突變SOD1有兩個主要的線粒體定位：IMS和線粒體外膜(oter mitochondrial membrane，OMM)。突變SOD1通過線粒體外膜蛋白進入IMS，并沉積在IMS中積累的不溶性聚集體中，從而掩蓋CCS的活性。然而，Chen等[20]發現在人ALS 運動神經元中SOD1 的聚集和線粒體的腫脹并不明顯，可能是由于人ALS神經元中SOD1的水平相對較低。此外，突變SOD1可能沉積在OMM上，從而干擾跨線粒體膜的轉運并參與線粒體細胞凋亡[19]。

2.1 突變SOD1與線粒體外膜 B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一種線粒體外膜上的抗凋亡蛋白，Bcl-2家族成員通過同二聚化，與同一家族中的蛋白質異二聚化或與其他蛋白質伴侶結合來調節細胞凋亡[21]。在表達G93A突變的轉基因小鼠脊髓中發現了促凋亡的蛋白BCL-2同源的水溶性相關蛋白(Bcl2-associated X，Bax)和B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(Bcl-2 associated death promoter，BAD)表達增加，而抗凋亡的Bcl-2表達減少[22]。SOD1突變體與Bcl-2結合，導致Bcl-2的構象發生變化，暴露出對線粒體有毒的BH3結構域，引起細胞色素c釋放，啟動了細胞內線粒體凋亡程序，伴隨線粒體形態改變：線粒體腫脹，廣泛空泡化以及cr斷裂。不僅如此，新暴露的BH3結構域可能與谷胱甘肽結合，抑制其抗氧化特性[23]。Bcl-2的構象與表型改變，不僅失去了其自身在細胞內的抗凋亡作用，還與突變SOD1一起對線粒體功能造成損害。電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel 1，VDAC1)是一種線粒體孔蛋白，能調節線粒體呼吸作用并且調節ATP經線粒體外膜流出至細胞質，同時也調控二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)進入線粒體進行氧化磷酸化[24]。有研究表明突變SOD1能夠直接抑制VDAC1的傳導，從而降低細胞質內ADP/ATP的比值和線粒體膜電位，造成線粒體功能障礙[25]。而這一種說法引起爭論，Tan等[26]通過實驗證明錯誤折疊的突變SOD1并非直接結合VDAC1，而是通過Bcl-2來使得VDAC1的電導下降。其中也可能存在突變SOD1同時結合Bcl-2與VDAC1而對線粒體產生毒害作用，這需要進一步的實驗來證明。但能夠肯定的是，無論是突變SOD1直接與VDAC1或間接通過Bcl-2作用而導致的VDAC1 電導降低，導致線粒體對ADP的通透性降低，能量產生減少并導致氧化應激，最終使線粒體發生超極化，細胞活性下降導致細胞死亡。

2.2 突變SOD1與線粒體動力學 線粒體根據需要不斷融合與裂變來維持自身的功能。功能受損的線粒體可通過與健康的線粒體融合來減少對細胞的傷害[27]，同時細胞也可利用線粒體裂變來分離受損嚴重的線粒體使其被降解[28]。早期就已經在ALS患者以及突變SOD1細胞培養、小鼠模型中發現線粒體形態以及超微結構異常，線粒體片段化增加[29-31]。線粒體分裂和融合的調控由鳥苷三磷酸酶(GTPases)的協同作用控制，控制線粒體裂變的蛋白是與動力蛋白有關的蛋白[32]；控制線粒體融合的蛋白則為線粒體融合蛋白1，2和視神經萎縮蛋白1(optical atrophy-1，OPA1)，前者控制線粒體外膜融合，后者控制內膜融合[33]。在培養的表達SOD1 G93A的神經干細胞(neural stem cell-34，NSC-34)中，OPA1水平的減少和動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)的水平升高導致了線粒體網絡斷裂[34]。Glutaredoxin 2的過表達通過恢復DRP1和OPA1的水平來恢復線粒體的正常功能和動力學，并阻止神經元凋亡[34]。同樣的，在表達SOD1 G93A的小鼠運動神經元中發現線粒體裂變與融合的比例增加，通過外源性表達線粒體去乙酰化酶和轉錄共激活因子阻止了突變SOD1 G93A的線粒體片段化和神經元細胞死亡[35]。突變SOD1為何會導致線粒體分裂與融合的相關蛋白表達水平失調目前尚不清楚。已知線粒體的融合受損會導致線粒體DNA位點突變或缺失，導致功能異常的線粒體在神經元中積累[30]。線粒體分裂異常會影響自噬清除受損線粒體過程[28]。總而言之，線粒體的動力學改變均會影響到神經元的正常功能，甚至引起神經元變性死亡。線粒體在胞體與特定細胞位置例如突觸之間的軸突運輸供能對神經元功能和存活至關重要。在表達SOD1 G93A小鼠首次報道發現坐骨神經軸突線粒體運輸存在缺陷，而后在表達突變SOD1的NSC-34運動神經元中也發現運輸缺陷[36-37]。在神經元中驅動蛋白負責順行運輸，動力蛋白負責逆行運輸，它們與適配器蛋白和膜受體蛋白相互作用，以驅動軸突運輸。Moller等[38]用實驗證明了ALS突變SOD1通過誘導磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)誘導的激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/泛素連接酶(PARKIN)信號通路且不依賴細胞鈣水平來降低膜受體蛋白的水平，從而導致神經元中線粒體逆行軸突運輸受損，而其中的導火索可能是突變SOD1引起的線粒體損傷誘導了PINK1磷酸化作用及后續的吞噬過程。突變SOD1引起神經元線粒體軸突運輸障礙的原因有很多[39-41]，包括突變SOD1在線粒體中聚集導致ATP生成減少，妨礙軸突運輸；突變SOD1與動力蛋白復合體相互作用形成聚集體影響軸突運輸等。各種途徑導致的遠端軸突運輸障礙退化最終會引起神經元的死亡，這符合提出的“垂死”假說，盡管后來這一假說受到了挑戰[42]。

2.3 突變SOD1與線粒體自噬 運動神經元再生能力低，需要通過自噬來清除錯誤折疊的蛋白質或者受損的線粒體來保持自身的穩態以及正常功能[43]。在ALS中自噬參與的標志之一是自噬小體在ALS患者脊髓神經元細胞質中的積累[44]。正常情況下，在線粒體中發生選擇性自噬，自噬受體在TANK結合激酶1(TANK binding kinase，TBK1)的作用下翻譯后修飾，增強了受體與泛素化底物(通常為受損線粒體和應激顆粒和SOD1突變聚集體)或細胞自噬標志物LC3的結合，隨后自噬泡開始形成并擴展形成自噬體，最終，自噬體與溶酶體融合，內容物被降解[45]。當編碼自噬相關蛋白的基因出現了突變或其中的某一個環節被阻斷，都有可能導致ALS。有證據表明在表達SOD1 G93A突變的ALS小鼠脊髓中出現自噬受體特異性聚集[46]，在無癥狀早期階段脊髓運動神經元出現特征性溶酶體缺陷，均導致了后續的自噬失調，且后者出現溶酶體的逆行運輸障礙[47]。由于突變的SOD1G93A與囊泡融合相關蛋白Snapin競爭性結合動力蛋白中間鏈(dynein intermediate chain，DIC)，干擾Snapin-DIC介導的動力蛋白向后期核內體的動力蛋白募集，從而減少它們在人SOD1 G93A 運動神經元中的逆行轉運，因此而降低了溶酶體運輸，造成自噬缺陷[47]。這表明軸突運輸與自噬功能相互影響。同時，在表達SOD1突變的ALS轉基因小鼠和NSC-34細胞模型中控制溶酶體生物合成的轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)的水平發生了改變， 由TFEB介導的自噬相關基因Beclin-1 mRNA和蛋白水平也出現了相同的改變，這一級聯反應導致的自噬改變可能是ALS發病機理中的關鍵因素[48]。文中也提出TFEB的過表達促進了體外自噬，最終延長細胞存活[48]。總而言之，ALS中不同途徑之間存在相互聯系，其他途徑很可能直接或間接影響自噬，反之亦然。神經元中相互作用的機制以及編碼蛋白基因的突變也會導致ALS中的自噬失調。因此，針對自噬失調提出的新策略可能是治療ALS的新方法。

3 ALS的治療對策

3.1 基因治療 盡管目前臨床并未出現針對ALS的有效藥物，但人們在探索ALS治療對策的道路上從未止步。近年來人們將治療重點轉移到了基因治療，通過向ALS SOD1突變小鼠的脊髓軟膜下注射腺相關病毒-短發夾RNA來沉默SOD1基因的表達，從而延緩疾病進展，阻止運動神經元的退化，尤其在小鼠癥狀前階段注射效果達到最好[49]。也有基于非載體的鞘內遞送反義寡核苷酸降低脊髓SOD1 mRNA和蛋白的濃度，延長了ALS SOD1突變大鼠的生存期，并且該方法在臨床的第一階段安全性與耐受性良好[50]。在臨床試驗中，Mueller等[51]通過向病人鞘內注射AAV抑制SOD1的蛋白合成；Miller等[52]則向病人鞘內注射反義寡核苷酸來介導SOD1 mRNA的降解；但以上臨床試驗均面臨著樣本量少，試驗周期長，嚴重的不良反應等巨大阻力，多種因素導致最終療效并不明顯，因此并未得出基因治療療效的確定性結論。因此，我們需要多階段重復試驗來驗證前人所取得的動物實驗結果，獲取有效治療靶點并將基因療法成熟應用與臨床中，及早為備受煎熬的ALS患者帶去曙光。

3.2 康復治療 康復治療可以幫助病患者發揮他們最大的潛力，讓他們盡可能獨立和安全地日常生活。ALS患者大多因呼吸困難死亡，因此需定期對患者進行肺功能評估，呼吸肌訓練能夠提高呼吸肌肌力，改善患者的通氣功能[53]；在嚴格監控下的運動訓練能夠延緩ALS損害患者的運動功能[54]；言語治療與康復護理能夠改善患者后期的構音障礙以及生活質量。ALS患者需要多學科交叉的綜合康復治療，才能最大程度地保留患者的殘存功能，從而減少患者心理與生理的痛苦，提高生活質量。

4 討論

SOD1突變是ALS中第一個發現的基因突變，從結構不穩定，導致折疊錯誤和聚集體形成已經被廣泛研究，其介導的線粒體功能障礙已經是ALS早期病理標志之一。線粒體障礙繼發引起ROS產生，氧化應激又加劇了SOD1的突變與錯誤折疊，如此形成惡性循環。由于復雜的致病機制，缺乏有效的治療靶點，盡管出現新興的基因治療策略，但還未在臨床中成功應用，康復能夠在一定程度上減輕患者功能障礙，但不能從根本上阻止ALS病程，因此ALS仍然是最嚴重的神經退行性疾病之一。ALS各信號途徑的互相串擾既為我們探明其發病機理增加了難度，又為我們研究ALS治療策略提供新的方向。隨著越來越多ALS相關研究的開展，人們最終會解開這一棘手的神經退行性疾病的神秘面紗。