microRNA在原發性膽汁性膽管炎發病機制及診斷治療中的作用

裴昱豐 王萍 賈繼東

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一類長度為19～24個核苷酸的非編碼小RNA分子，可以通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA的3’端非轉錄區(3′ untranslated region, 3′UTR)相結合，在轉錄后水平促進目標mRNA的降解或阻止其翻譯從而下調該基因的表達。作為重要的表觀遺傳學分子，miRNA可參與細胞命運決定、免疫功能調節、組織發育調控等多種生物學過程。目前已經發現了2 500余種miRNA分子，而一個miRNA可以調節上百個編碼基因的表達，因此miRNA和基因表達的關系非常復雜。

原發性硬化性膽管炎(Primary biliary cholangitis, PBC)是一種自身免疫介導的、中年女性多發的肝內膽汁淤積性疾病。本病臨床上以血清中堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)升高和抗線粒體抗體尤其是M2亞型(Anti-mitochondrial antibody subtype M2，AMA-M2)陽性為主要特點，病理上以肝內小膽管細胞非化膿性變性、壞死及匯管區淋巴細胞浸潤為主要特征。PBC患者肝組織[1]、外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)[2]、血清[3]中miRNA的表達譜均有顯著變化，這些差異表達的miRNA可參與激活免疫反應、促進膽管細胞凋亡等過程，從而導致PBC疾病的發生與進展。本文將綜述miRNA調控PBC發生、進展的細胞分子機制和miRNA用作PBC疾病的診斷標志物和治療靶點的研究進展。

一、miRNA調控PBC疾病發生、進展的細胞分子機制

(一)miRNA參與PBC中免疫細胞的活化過程 PBC的發生、進展過程涉及多種免疫細胞的功能失調，包括調節性T細胞(regulatory T cells, Treg)功能下降、具有促炎作用的輔助性(T helper, Th)17細胞增多、匯管區CD4+與CD8+T淋巴細胞浸潤、B細胞產生針對抗線粒體E2亞基(Pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)的自身抗體等。利用基因芯片對PBC患者與健康對照PBMC、CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞檢測結果發現，很多差異表達的miRNA在PBC免疫細胞活化方面發揮了重要作用。

1. PBMC中miR-155表達增加與Treg細胞的免疫抑制功能下降有關

與健康對照相比，PBC患者PBMC中具有免疫抑制功能的Treg細胞數量與比例均顯著下降，Treg細胞分泌的、具有抑炎作用的白細胞介素(Interleukin, IL)-10也明顯減少，導致T細胞數量增加、抗原遞呈細胞(包括樹突細胞和B細胞)中共刺激分子CD86表達顯著增加，進而促進了PBC的疾病進展[4]。細胞因子信號轉導抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)-1可增強Treg細胞的免疫抑制功能[5]，而PBC患者肝組織中，SOCS-1表達水平與Treg細胞標志物FoxP3表達水平的比值較健康對照顯著下降，同時miR-155水平顯著升高，提示miR-155表達增加可能參與了降低Treg細胞的免疫抑制功能，導致炎癥反應加重[6]。

2. PBMC中miRNA-92a表達下降增加了促炎Th17細胞數量

IL-17是主要表達于Th17細胞的促炎細胞因子。與健康對照相比，PBC患者血清中、PBMC中及肝臟匯管區IL-17水平均顯著升高，而且PBMC中IL-17的表達水平與PBC嚴重程度正相關[7]，提示Th17細胞數量增加或功能增強可能與PBC疾病密切相關。PBC患者血清miR-92a的水平較健康對照顯著降低，且miR-92a水平與Th17細胞數量增加之間呈負相關，表明miR-92a表達降低與PBC患者中促炎Th17細胞數量增加有關[3]。

3. CD4+T細胞中miR-425、miR-181a表達下降加重了PBC的炎癥反應

PBC患者膽管細胞表達的PDC-E2遞呈給CD4+T細胞后，PBC患者的外周血、肝臟、肝臟引流淋巴結中，針對PDC-E2的自身反應性CD4+T細胞數量較健康對照顯著增加，同時Th1細胞表達的干擾素(Interferon, IFN-γ)水平亦顯著升高。在PBC患者CD4+T細胞中發現了5個較健康對照者表達顯著下調的miRNA (miR-181a、181b、361-5p、374b和425)[8]。其中，miR-425可以結合到N-Ras mRNA的3’-UTR區并抑制其表達，而N-Ras具有促進炎癥因子IL-2與IFN-γ表達[8]和促進CD4+T細胞活化的作用[9]。PBC患者CD4+T細胞中N-Ras表達顯著增加[9]，可能是由于miR-425表達下降導致了N-Ras水平升高，加重了CD4+ T細胞介導的炎癥反應。另外，miRNA-181a也是被驗證過在PBC患者CD4+T細胞中較健康對照、慢性乙型肝炎患者表達顯著下降的miRNA，其表達水平與靶基因BCL-2表達水平呈負相關，提示CD4+T細胞中miR-181a表達降低使得BCL-2表達增加，由于BCL-2具有抑制淋巴細胞凋亡的作用，提示miR-181a可能與PBC中CD4+T細胞相關炎癥反應加重有關[10]。

醫院信息中心確保時時維護和管理醫院醫保系統，保證醫保電腦專機專用并有備機，由信息中心專職技術人員專人負責，及時排查系統故障，保障醫院系統的正常運行。如遇社保局網絡故障，盡快與其溝通，并做好患者及家屬的安撫工作，網絡恢復后及時辦理相關業務。

4. B淋巴細胞中miR-223-3p、miR-21-5p表達下降與自身抗體分泌增加有關

在PBC患者，持續的B細胞活化導致了血清PDC-E2抗體、抗核抗體(gp210、sp100)水平顯著升高[11]。與健康對照相比，PBC患者外周血B淋巴細胞中有558個差異表達的miRNA，其中miR-223-3p和miR-21-5p的表達從I期到III期PBC患者持續顯著下降。這些miRNA所針對的靶基因涉及細胞遷移、分化、凋亡和信號傳遞等生物學過程，可能與PBC疾病進展過程中B細胞成熟分化、分泌針對PDC-E2抗體有關[12]。

(二) miRNA參與膽管細胞功能障礙和肝細胞損傷的過程 PBC以表達PDC-E2的膽管細胞受到免疫細胞特異性攻擊為特征。盡管研究發現遺傳因素、環境因素都可能參與了PBC的誘發過程，但是具體誘因目前仍未確定。一些證據顯示，miR-26a、miR-506表達增加導致膽管細胞功能障礙；而miR-210與miR-21參與了PBC所致肝臟膽汁淤積對肝細胞的損傷過程。

1. 膽管細胞中miR-506表達增加導致其功能障礙

利用miRNA芯片技術比較PBC肝移植患者的病肝組織與非肝病對照者的肝組織，發現了35種差異表達的miRNA[1]。后續研究發現，其中的miR-26a與miR-506參與了PBC的疾病發生過程。

PBC患者肝組織中高表達的miR-26a，可以特異性地靶向多梳家族蛋白——Zeste2多克隆抑制復合物2亞單位增強子 (enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)，導致EZH2蛋白表達水平降低[13]。由于EZH2能通過募集Bmi1促進膽管細胞增殖、抑制其衰老[14]，因此miR-26a可能通過降低EZH2的表達，從而發揮抑制膽管細胞增殖、促進其衰老的作用。

miR-506特異性地表達于膽管上皮細胞，在PBC患者肝組織中其表達水平顯著增加[15]。促炎細胞因子IL-8、IL-12、IL-17、IL-18及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α具有上調miR-506表達的作用[16]。過表達miR-506可以增加膽管上皮細胞內的活性氧水平、PDC-E2表達水平及DNA損傷標志物的表達水平，而且增加的PDC-E2不僅位于細胞質中，也位于細胞膜上，這導致膽管細胞成為免疫細胞攻擊的靶點[16]。

正常情況下，膽管細胞通過分泌HCO3-使膽汁呈弱堿性，并形成碳酸氫鹽保護傘，從而避免膽汁酸直接作用于膽管細胞。當膽管細胞miR-506表達增加時，miR-506可以結合到Cl-/HCO3-陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)mRNA的5’-UTR區，進而降低膽管細胞的AE2表達水平與活性[15]。由于AE2是分泌素刺激膽管細胞分泌碳酸氫鹽、維持膽汁pH穩態的關鍵分子，缺少AE2使得膽管細胞對疏水性膽汁酸鵝脫氧膽酸或甘氨鵝去氧膽酸誘導的細胞凋亡更加敏感[16]。miR-506還可結合于膽管細胞特異性表達的三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, InsP3R)mRNA的3’-UTR區域，降低其蛋白表達水平[17]。由于InsP3R3能通過Ca2+信號來調控膽管細胞向膽汁中分泌碳酸氫鹽[18-19]，故缺少InsP3R可以抑制膽管細胞碳酸氫鹽的分泌過程，導致膽管細胞處于應激狀態且細胞凋亡增加[20]。有研究結果顯示，向膽管上皮細胞中轉染miR-506的反義序列可以降低miR-506水平，從而降低PDC-E2表達、促進膽管細胞碳酸氫鹽分泌、減輕膽管細胞損傷，是非常有前景的PBC治療靶點[15]。

2. 肝細胞中miR-210與miR-21表達增加加重了膽汁淤積對肝細胞的損傷

在PBC的病理發生過程中，膽管細胞損傷所導致的膽汁淤積狀態也會對肝細胞產生不利影響。有研究發現，膽汁淤積性肝損傷小鼠模型和PBC患者肝組織中miR-210與miR-21的表達水平較正常對照均顯著增加。miR-210能抑制肝細胞中法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)的共刺激分子——混合性白血病甲基轉移酶(methyltransferase in mixed-lineage leukemia, MLL)4基因表達，從而阻斷MLL4促進小異二聚體伴侶分子(small heterodimer Partner, Shp)和膽鹽輸出泵(bile salt export pump, Bsep)基因的表達，最終導致肝臟膽汁酸代謝障礙與膽汁淤積[21]。miR-21可通過細胞周期蛋白依賴激酶2相關蛋白1 (cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1, CDK2AP1)促進肝細胞壞死；去除miR-21能夠減輕肝細胞壞死、改善對膽汁酸的適應性應答、并能夠改善氧化應激與肝纖維化[22]，提示miR-21有可能作為膽汁淤積性肝病的治療靶點。

二、miRNA有助于PBC的鑒別診斷、疾病分期評估和療效評價

miRNA在血清中穩定存在，不易被RNA酶降解，所以血清和PBMC中差異表達的miRNA都可能作為輔助PBC診斷和評價療效的生物標志物。

(一)miRNA可作為PBC診斷的輔助標志物 PBC發病隱匿，目前臨床多根據血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝臟組織病理學進行診斷。但是，也有AMA-M2陰性的PBC患者，且早期病例ALP水平并不一定升高。有研究發現，miR-let-7b在PBC患者PBMC中表達水平較健康對照者顯著降低，而且與疾病分期、Mayo風險評分、血清 IL-18水平及血清ALP水平呈負相關[23]，有可能作為PBC早期診斷的輔助標志物。

有研究發現，將三種miRNA組合(miR-122-5p、miR-141-3p和miR-26b-5p)診斷PBC的受試者工作特征曲線下面積(area under a receiver operating characteristic curve, AUC)為0.905(95%置信區間：0.857～0.953，敏感性80.5%，特異性88.3%)，其敏感性和特異性高于ALP(AUC=0.537，95%置信區間：0.195～0.434,P<0.001)和ANA(AUC=0.739, 95%置信區間：0.012～0.213,P=0.028 2)，但低于AMA(AUC=0.982，95%置信區間：0.0618～0.198,P=0.0002)；值得注意的是，這種miRNA組合診斷PBC臨床前階段、無癥狀階段、有癥狀階段及肝功能不全期的AUC分別為0.835、0.879、0.867及0.901[24]，提示該miRNA組合亦可能作為PBC早期診斷的血清標志物。

miR-150可能通過靶向B前體細胞c-Myb mRNA降低轉錄因子c-Myb的表達水平，進而阻斷B細胞發育并降低B細胞抗體合成[25]。有研究發現，AMA陰性PBC患者血清miR-150水平顯著高于AMA陽性PBC患者及健康對照組，并與AMA抗體滴度負相關[26]，提示miR-150可以作為輔助診斷AMA陰性PBC的血清標志物。

(二) miRNA有助于PBC與其他慢性肝病的鑒別診斷 PBC與其他慢性肝病的鑒別診斷也是困擾臨床醫生的問題。血清miRNA深度測序與實時熒光定量PCR驗證結果顯示，PBC患者血清miR-505-3p和miR-197-3p水平顯著低于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎[27]。另有研究顯示，PBMC中 miR-26a、miR-299-5p、miR-328及miR-let-7a水平，可以鑒別PBC與AIH[28]。

(三)miRNA有助于評價PBC患者的治療應答情況 目前，熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是PBC治療首選的藥物。盡管UDCA對多數患者的膽汁淤積狀況均有一定程度改善，但生化指標檢測結果顯示仍有30%～40%患者應答不佳。血清miRNA芯片分析結果顯示，miR-125b、let-7b和miR-520a-5p有助于識別出UDCA應答不佳的PBC患者[29]。而PBMC中miRNA檢測結果顯示，UDCA應答不佳者miR-299-5p表達顯著高于正常對照者，并與ALP、GGT、總膽紅素、IgM水平呈正相關，而且中重度膽管炎PBC患者(2-3級)比輕度膽管炎PBC患者(0-1級)的miR-299-5p表達水平更高[28]，提示PBMC中的miR-299-5p有可能作為評價UDCA應答不佳患者的指標。

三、總結與展望

總之，多種miRNA分子參與了PBC疾病發生、進展中免疫細胞的活化過程與肝臟細胞的損傷過程。針對肝臟細胞損傷過程，miR-506的反義序列具有減輕膽管細胞損傷的作用，miR-21可以改善肝細胞對膽汁酸的適應性應答，都是非常有前景的PBC治療靶點。針對免疫細胞活化過程，盡管發現了很多相關的miRNA，但目前相關機制研究尚不充分，仍未發現可用于治療PBC的miRNA靶分子。

基于PBC患者血清和PBMC中miRNA，目前發現了一些在PBC疾病鑒別診斷、分期評估和療效評價方面有價值的miRNA或miRNA組合，是對目前臨床上通過血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝臟組織病理學對PBC疾病進行評估的重要補充，期待經過大規模的臨床前驗證后，能夠有相關的診斷試劑盒應用于臨床，以提高PBC患者診斷的準確性，幫助醫生盡早發現UDCA應答不佳患者并優化治療策略。