外泌體在腦膠質(zhì)瘤中的研究進展

談胤求綜述 陳謙學(xué)審校

外泌體是直徑在40～120 nm之間的膜性囊泡，可被細胞攝取及分泌[1]。研究表明，外泌體內(nèi)包含具有生物活性的RNA及蛋白質(zhì)，能夠通過外泌體進行細胞間的轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物作用[2-4]。越來越多的研究證實，在眾多癌癥中，外泌體內(nèi)特定物質(zhì)(miRNA和/或蛋白)的改變與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[5-8]。文章將對外泌體的構(gòu)成、起源、功能及其在人腦膠質(zhì)瘤治療中的作用進行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的構(gòu)成 在電子顯微鏡下可觀察到外泌體是具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的半球形結(jié)構(gòu)[9]，在外泌體的水囊內(nèi)和膜上包含很多核酸、蛋白質(zhì)，根據(jù)外泌體細胞來源的不同，其表面還含有許多不同的受體。外泌體中存在許多類型的蛋白質(zhì)，包括與細胞間膜融合相關(guān)的膜聯(lián)蛋白和ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白(RAB蛋白)，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白激酶和異源三聚體的G蛋白，有與代謝相關(guān)的酶如過氧化物酶、脂質(zhì)激酶和烯醇酶-1，還有與抗原提呈相關(guān)的熱休克蛋白HSP70和HSP90[10]。另外四分子交聯(lián)體家族成員也是外泌體中含量豐富的蛋白，包括CD9、CD63、CD81和CD82，它們可與主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子及整合素發(fā)生相互作用[11]。

1.2 外泌體的形成 外泌體的形成主要有2個步驟，首先是來源于內(nèi)向萌芽的部分內(nèi)體膜，其包裹著細胞合成的蛋白與核酸等物質(zhì)，形成管腔囊泡(intraluminal vesicles)，外泌體中也發(fā)現(xiàn)了識別胞質(zhì)蛋白的抗體，如HSC70[12]。之后，多個管腔囊泡共同形成多胞體(multivesicular body，MVB)，部分多胞體能夠暴露出胞質(zhì)的轉(zhuǎn)膜蛋白結(jié)構(gòu)域，從而與細胞質(zhì)膜融合，形成外泌體向胞外釋放，剩下的則被溶酶體降解[13]。

1.3 外泌體的分泌 外泌體通過晚期內(nèi)吞作用的間室與質(zhì)膜融合的形式分泌到胞外，這種融合是細胞中最基本、最普遍的形式。而在T細胞和肥大細胞中，這種融合則需要依賴鈣離子才能激活[14]。目前對于這種融合的分子機制研究甚少，大部分細胞內(nèi)膜的融合發(fā)生都由特定的蛋白機制所決定，比如可溶性因素，其中包括N-乙基馬來酰亞胺敏感的因素(NSF)、可溶性NSF黏附蛋白(SNAP)，以及膜復(fù)合物因素，比如SNAP黏附蛋白受體(SNARE)。發(fā)生融合的2種膜需要具有相應(yīng)的SNARE，即囊泡SNARE(v-SNARE)和目標(biāo)SNARE(t-SNARE)[15-16]。另外外泌體的分泌還受到Rab27a和Rab27b的控制，抑制這兩種Rab27的受體：突觸結(jié)合蛋白樣4(synaptotagmin-like 4)和EXPH5(exophilin 5)能夠抑制外泌體的分泌[17]，但是最近又有研究顯示，敲除PC-3中的Rab27b能夠增加外泌體的釋放[18]。目前還不清楚外泌體分泌的具體調(diào)節(jié)機制，上述相關(guān)分子在外泌體分泌中發(fā)揮的作用也仍需進一步探究。

1.4 外泌體的功能 外泌體可以從不同類型的細胞中釋放出來，能夠通過轉(zhuǎn)運脂質(zhì)、蛋白及核酸到接收細胞來調(diào)節(jié)細胞的生物活性。在免疫應(yīng)答、腫瘤進展及神經(jīng)退行性改變等過程中，外泌體都發(fā)揮著重要作用。在抗腫瘤T細胞免疫應(yīng)答方面，外泌體也參與了MHC的抗原呈遞過程[19]。在腫瘤進展方面，胰腺癌PANC-1細胞來源的外泌體不僅能夠分泌Wnt5b，促進腫瘤增殖與遷移，而且這種現(xiàn)象還在肺癌及結(jié)腸癌細胞系中存在[20]。在血管生成方面，內(nèi)皮細胞分泌的外泌體富含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，可以刺激鄰近腫瘤血管的生成[21]。然而對于外泌體生物學(xué)功能的具體分子機制仍不明確，其作用可能受其被分泌和攝取及復(fù)雜的內(nèi)容物等因素影響。

2 外泌體與腦膠質(zhì)瘤

2.1 腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生進展 由于外泌體本身包含許多核酸、蛋白，而且可以在細胞間進行交換，因此其可被利用為生物載體，去影響特定的細胞或分子。在膠質(zhì)瘤中，外泌體也同樣能夠通過轉(zhuǎn)運其內(nèi)含物到膠質(zhì)瘤細胞中，從而影響膠質(zhì)瘤的生長[22]。膠質(zhì)瘤釋放的外泌體能夠激活糖酵解通路，從而使間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出腫瘤樣生長[23]。級別越高的膠質(zhì)瘤，其釋放的外泌體含量越多[24]。膠質(zhì)母細胞瘤干細胞來源的外泌體含有Notch1蛋白，通過激活Notch1信號通路使非干細胞性膠質(zhì)瘤的干細胞性和成瘤能力增加[25]。另外，膠質(zhì)母細胞瘤血清循環(huán)外泌體中的miRNA-148a水平更高，抑制miRNA-148a能夠抑制STAT3通路從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。同時，骨髓基質(zhì)細胞分泌的含有miRNA-375的外泌體也能夠通過抑制SLC31A1從而抑制膠質(zhì)瘤進展[27]。這些結(jié)果表明，外泌體與膠質(zhì)瘤之間存在非常復(fù)雜的作用關(guān)系，特定來源的外泌體能夠影響膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

2.2 腦膠質(zhì)瘤的診斷 液體活檢是一種快速、廉價的獲取腫瘤相關(guān)信息的方法，并且采集方便[28]。利用腫瘤分泌的外泌體可作為功能性生物標(biāo)志物。在臨床實踐中利用腫瘤來源的外泌體和相關(guān)核酸及蛋白的分析也有助于以非侵入性的方式建立診斷[29]。理想的生物標(biāo)志物具有為各種臨床應(yīng)用提供重要信息的潛力，如能夠進行疾病進展的早期檢測，腫瘤的分子亞型分類及預(yù)測對治療可能發(fā)生的反應(yīng)。在膠質(zhì)母細胞瘤中鑒定此類生物標(biāo)志物將實現(xiàn)基于分子水平的檢測方法，對患者組織活檢和腫瘤進展的MR評估進行補充。MR的特異度范圍在50%～80%之間，通常能區(qū)分膠質(zhì)母細胞瘤與其他顱內(nèi)病變，但已被證實可能錯過早期病變，其分辨率極限為2～3 mm[30-31]。MR在評估早期腫瘤進展中具有顯著的局限性。目前，一些含特定蛋白或RNA的外泌體已被鑒定為神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性生物標(biāo)志物，包括EGFR、IDH1和miRNA-21[32]。miRNA-21是已知的EGFR表達調(diào)節(jié)因子，所有膠質(zhì)母細胞瘤患者的腦脊液中均可以檢測到，是膠質(zhì)母細胞瘤檢測的高敏感度標(biāo)志物[33]。除了用于膠質(zhì)瘤的診斷，miRNA-21、miRNA-222及miRNA-124-3p還可以用來區(qū)分腫瘤假性進展和真性復(fù)發(fā)[34]。因此，在血液、腦脊液和其他體液中檢測特異性腫瘤標(biāo)志物，對膠質(zhì)瘤的診斷及腫瘤進展的監(jiān)視也具有重要意義[35]。雖然從腦脊液、血液和尿液中提取外泌體非常方便，并且創(chuàng)傷小，但是哪種體液的準(zhǔn)確性更高，或是否需要聯(lián)合使用多種體液進行診斷，目前還沒有定論。

2.3 腦膠質(zhì)瘤治療價值

2.3.1 腦膠質(zhì)瘤化療：外泌體可以作為腫瘤對臨床治療敏感性的生物標(biāo)志物。O-6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是一種能夠修復(fù)替莫唑胺處理引起DNA損傷的酶。研究顯示，MGMT的啟動子DNA甲基化能夠降低細胞中特定核蛋白的表達，從而增強替莫唑胺對膠質(zhì)母細胞瘤患者的療效。22%～57%的膠質(zhì)母細胞瘤患者能夠檢測到MGMT啟動子區(qū)的甲基化，而利用免疫磁性外泌體RNA分析患者血清發(fā)現(xiàn)，在表現(xiàn)為耐藥的患者中，經(jīng)過替莫唑胺治療后外泌體信使RNA表達水平升高[36-37]。膠質(zhì)瘤細胞能夠刺激正常人星形細胞轉(zhuǎn)變成反應(yīng)性星形細胞，而反應(yīng)性星形細胞能夠釋放含有更多MGMT信使RNA的外泌體，這些外泌體被MGMT陰性的膠質(zhì)瘤攝取后便可獲得替莫唑胺抵抗能力[38]。在替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細胞分泌的外泌體中，miRNA-2138表達明顯升高。這種由耐藥膠質(zhì)瘤分泌的含miRNA-2138的外泌體被替莫唑胺敏感的膠質(zhì)瘤細胞攝取后也能獲得耐藥性[39]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤外泌體的miRNA-221同樣能夠影響腫瘤對替莫唑胺的敏感性[40]。其他分子的表達也可以提供標(biāo)志物的間接定量，包括miRNA-603和miRNA-181d，其表達與MGMT表達水平直接相關(guān)[37]。因此，可以在治療期間監(jiān)測以跟蹤了解患者對治療的反應(yīng)。

2.3.2 膠質(zhì)瘤免疫治療：外泌體可以調(diào)控免疫系統(tǒng)以識別選定的腫瘤相關(guān)突變或抗原，形成免疫治療方法的基礎(chǔ)，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞可以利用血腦屏障部分地逃避免疫應(yīng)答，但免疫療法為膠質(zhì)母細胞瘤患者提供了一種有吸引力的治療方法，因為它們往往被免疫抑制，這種方法同時針對特定的腫瘤細胞群，也可以增強其免疫系統(tǒng)。與化學(xué)療法或放射療法不同，免疫療法能夠潛在地靶向腫瘤細胞，同時保留非腫瘤細胞。最早Zitvogel等[41]觀察到在腫瘤多肽存在下孵育的樹突細胞會釋放外泌體，刺激細胞毒性CD8+T淋巴細胞并抑制鼠模型中腫瘤生長。進一步研究揭示樹突細胞來源的外泌體(dendritic cell derived exosomes,DCDE)表達MHCⅠ類和Ⅱ類，其允許外泌體將非自身蛋白的肽片段展示給細胞毒性T細胞。DCDE在其脂質(zhì)雙層中也含有CD63，這是一種共刺激蛋白，有助于在抗原呈遞過程中引導(dǎo)T細胞[42]。因此，樹突狀細胞也被用作疫苗，對膠質(zhì)瘤進行免疫治療[43]。作為細胞間通信和免疫功能的焦點介質(zhì)，外泌體可以對包括B淋巴細胞、T淋巴細胞和單核細胞的免疫細胞發(fā)揮作用[44]。這為外泌體提供了增強調(diào)理作用，調(diào)節(jié)抗原呈遞，誘導(dǎo)免疫激活和改變免疫抑制的能力[45]。通過檢測外泌體中的蛋白及RNA還能反映出膠質(zhì)瘤患者對于抗腫瘤疫苗使用的效果[46]。而膠質(zhì)瘤干細胞自身分泌的外泌體則能夠促進腫瘤的免疫逃逸[47]。然而，有文獻報道，膠質(zhì)瘤來源的外泌體在免疫抑制上的能力很有限，僅觀察到了免疫抑制的HLA-DR的單核細胞表型，但是并沒能誘導(dǎo)PD-L1的表達及細胞毒性T細胞的激活[48]。膠質(zhì)瘤的免疫逃逸可能還涉及其他機制，但是外泌體在膠質(zhì)瘤免疫治療中的作用正在不斷被挖掘。

2.4 膠質(zhì)瘤預(yù)后評估 膠質(zhì)瘤的預(yù)后與多種因素相關(guān)，其中包括患者年齡、腫瘤級別、腫瘤分子病理分型等。而膠質(zhì)瘤外泌體的含量不僅與腫瘤級別呈正相關(guān)，還與預(yù)后呈負相關(guān)[24]。同樣的，外泌體中的miRNA不僅可以用來進行診斷和治療，還可以預(yù)測患者預(yù)后。研究表明，血清外泌體miRNA-301a、miRNA-30a-5p及miRNA-210低水平組的生存率較對應(yīng)的高水平組更高[49-51]。另外，血清外泌體的miRNA-181b含量越高，患者的術(shù)后存活時間就越短，并且還提示患者有更差的功能結(jié)果及腫瘤相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[52]。而利用血清外泌體中的HOTAIR水平也可預(yù)測膠質(zhì)母細胞瘤的預(yù)后，并且準(zhǔn)確度和敏感度都較高[53]。通過生物信息學(xué)分析及臨床標(biāo)本驗證也發(fā)現(xiàn)，血清外泌體的miRNA-210、miRNA-449及miRNA-5194均與膠質(zhì)瘤的級別、診斷、侵襲及預(yù)后相關(guān)。未來通過更加深入地對外泌體的研究可能發(fā)現(xiàn)更多針對膠質(zhì)瘤預(yù)后的敏感度和特異度都極高的分子。

3 小結(jié)與展望

已知外泌體與其他細胞外囊泡一起作用于供體和受體細胞的長距離通信，以遞送許多分子和分子信息。研究表明，外泌體可參與許多基于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)節(jié)，并且影響腫瘤對免疫和藥物的反應(yīng)。腫瘤細胞分泌的外泌體不僅可以促進腫瘤自身的生長，還能夠通過影響瘤周微環(huán)境促使正常細胞向有利于腫瘤生長的方面改變，如內(nèi)皮細胞血管生成增加等。通過檢測、調(diào)控膠質(zhì)瘤來源的外泌體可能會給膠質(zhì)瘤的診斷和治療帶來突破性進展。然而外泌體領(lǐng)域的研究尚不深入，特別是在膠質(zhì)瘤方面的研究還處于起步階段。未來更全面地了解外泌體將會給膠質(zhì)瘤乃至其他腫瘤的治療帶來新的希望。