新型冠狀病毒疫苗的研究進展

鄧凱麗 舒磊 魏靜 陳曉林 馮旰珠

南京醫科大學附屬逸夫醫院呼吸內科211100

新型冠狀病毒肺炎 (COVID-19)暴發流行對全球公眾健康構成了嚴重威脅。COVID-19患者與2003年嚴重急性呼吸綜合征和2012 年中東呼吸系統綜合征患者癥狀相似,表現出一系列包括干咳、發熱、頭痛、呼吸困難等癥狀,病死率達3%～5%[1]。截至2021年3月28日,全球超過1.2億人確診COVID-19,273萬人死亡,同時該病給全球帶來嚴重的經濟損失[2]。

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndro me coronavirus 2,SARS-Co V-2)隸屬冠狀病毒β屬,由日冕狀包膜和單鏈RNA 基因組組成。基因組RNA 和核蛋白 (N)被埋在磷脂雙層中,包膜結構蛋白主要包括基質蛋白 (M)、病毒包膜 (E)和刺突蛋白 (S),M 蛋白和E蛋白位于S蛋白之間,在病毒裝配中起重要作用[3]。S蛋白介導病毒與細胞膜的融合,與病毒入侵的毒力有關,是誘導機體產生細胞免疫和體液免疫的主要抗原成分[4]。在當前COVID-19大流行趨勢下開發疫苗就是人類和病毒之間的賽跑,許多國家都加快了疫苗臨床試驗的研究進程。目前約有268 種候選疫苗在世界范圍內研制,包括滅活病毒疫苗、減毒活疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗 (mRNA 疫苗和DNA 疫苗)、重組亞單位疫苗等。截至2021年3 月底,已有84 種SARS-Co V-2 疫苗處于臨床研究階段[5-6],本文就SARS-Co V-2疫苗研究進展進行如下綜述。

1 滅活病毒疫苗

滅活病毒疫苗是一種傳統的疫苗生產方式,即采用化學方法 (如甲醛溶液、β丙內酯或焦碳酸二乙酯)或放射線照射方法使病毒基因組失去感染性,同時保留抗原性,消除了潛在的感染力。滅活疫苗的開發和生產策略是一項常規和成熟的技術,相較于其他類型疫苗能提供更全面的保護作用,同時具有更高的安全性。目前臨床使用的流感病毒疫苗、脊髓灰質炎病毒疫苗均屬于純化滅活病毒疫苗。但滅活疫苗保留了病毒的全部蛋白,其成分相對復雜,可能會引起不良反應。

秦川、高強等多個科學團隊聯合研發了一種純化滅活SARS-Co V-2候選疫苗 (Pi Co Vacc),研究人員使用β丙內酯進行病毒滅活后進一步純化制備為待用疫苗[7]。最初在小鼠和大鼠體內進行d0和d7雙劑免疫,Pi Co Vacc免疫后的小鼠血清中S蛋白特異性抗體是恢復期人類血清中的10倍,表明Pi Co Vacc具有誘發強力有效免疫反應的潛力。研究者進一步在恒河猴體內進行免疫接種以評估Pi Co Vacc的免疫原性和保護效力,d0、d7 和d14 三劑肌肉接種免疫,d22進行氣管內攻毒,d29收集標本。恒河猴體內S蛋白特異性Ig G 和中和抗體均在第2周被檢測到,并在第3周繼續增加,抗體滴度與恢復期人類血清水平相似;氣管內攻毒后,高劑量組 (6μg)恒河猴感染后的第7 天,咽喉、肛門和肺部均未檢測到病毒;中劑量組 (3μg)感染后第7天,咽喉、肛門和肺部標本中部分能檢測到病毒斑點,但與對照組相比病毒載量降低了約95%,且對照組的恒河猴肺部表現出嚴重的間質性肺炎,而免疫組肺部組織病理變化明顯減輕。Pi Co Vacc能夠在非人靈長類動物中誘發有效的免疫應答,并提供完全保護作用;接種了Pi Co Vacc疫苗的恒河猴體內未觀察到抗體依賴的增強效應或免疫病理惡化及明顯的發熱、體質量下降等不良反應。

Wang等[8]共同參與研制的滅活候選疫苗BBIBP-Cor V也被證實具有較好的免疫原性及保護效力。其首先在小鼠體內分別進行單劑 (d0)、雙劑 (d0、d7)、三劑 (d0、d7、d14)的腹腔接種,結果表明無論是低、中、高劑量組,三劑免疫接種方案所產生的抗體滴度均高于單劑和雙劑免疫。研究人員進一步在獼猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠體內分別進行不同劑量 (2、4、8μg)的免疫接種,發現所有動物模型在免疫后21 d抗體血清轉化率達到100%,同時沒有觀察到抗體依賴的增強效應和免疫病理損傷。恒河猴體內免疫-攻毒實驗中觀察到所有安慰劑組恒河猴在攻毒后整個評估期,咽拭子和肛拭子均維持較高的病毒載量;免疫組咽拭子和肛拭子病毒載量在攻毒后7 d均明顯下降,部分未檢測到病毒載量。在免疫組恒河猴的任一肺葉中均未檢測到病毒,而安慰劑組在左、右肺均檢測到較高的病毒載量,且病理組織學分析表現為嚴重間質性肺炎。為了進一步驗證該疫苗安全性,單劑肌肉接種大鼠后連續觀察14 d,并沒有出現死亡事件或嚴重的不良反應,與安慰劑組相比較也沒有明顯的體質量下降或食欲下降,重要器官內沒有觀察到任何組織病理學改變。最長在獼猴接種后觀察到36 d,同樣沒有出現明顯的不良反應。

2020年9月多款滅活病毒疫苗相繼開展Ⅱ/Ⅲ期隨機、雙盲、對照臨床試驗,結果均表明疫苗具有較好的免疫原性及安全性。滅活病毒疫苗于2020年底開始面向北京、武漢等地接受預約接種[9]。目前我國已全面開展全民疫苗接種工作,截至2021 年4 月13 日,各地累計報告接種SARS-Co V-2疫苗超過1.7億劑次[10]。

2 減毒活疫苗

減毒活疫苗的成功應用具有悠久的歷史,天花疫苗、脊髓灰質炎疫苗等均屬于減毒活疫苗,通過對病原體分子或結構蛋白的處理使其發生變異毒性減弱,但仍保留其免疫原性。減毒活疫苗的免疫過程與自然感染非常相似,且通常其免疫原性高于非復制性疫苗。

冠狀病毒E蛋白參與誘導細胞內質網應激和宿主細胞炎性細胞因子過表達,從而導致肺組織損傷、水腫,并進一步發展為ARDS,缺少E 蛋白的冠狀病毒由于裝配失敗和成熟缺陷,導致其存在形態和功能的異常。研究已表明冠狀病毒缺少E蛋白可以減輕宿主細胞的應激反應,E 蛋白缺失減毒活疫苗可在小鼠和倉鼠上誘導產生體液和細胞免疫應答,而且可實現攻毒后部分保護作用[11-12]。

近年來,越來越多的研究表明卡介苗在呼吸系統和其它病毒感染 (黃熱病毒和門戈病毒,與SARS-Co V-2一樣都屬于RNA 病毒)以及人體免疫強化中發揮重要作用[13-14]。有研究表明世界上部分未普及卡介苗接種的國家,如意大利和美國,SARS-Co V-2 相關的死亡率要高于長期普及卡介苗接種的國家 (如韓國和日本)[15]。目前在美國臨床試驗數據庫平臺注冊的相關研究已有7項,其中4項正在招募試驗者,主要針對一些高危人群,比如醫護人員接種卡介苗能否避免感染SARS-Co V-2[14]。荷蘭、德國、英國和澳大利亞也在進行相似的試驗計劃[16-18]。

3 病毒載體疫苗

將疫苗靶基因整合入載體基因組中制備成病毒載體疫苗,可以感染細胞并在細胞質內表達靶抗原,因此可高效誘導機體產生體液和細胞免疫應答,并且具有天然黏膜嗜性。通過鼻腔或口腔接種病毒載體疫苗還能誘導黏膜免疫反應,是近幾年發展最為迅速的疫苗類型。但常用的病毒載體腺病毒是一種常見感冒病毒,人體通常存在預存免疫力,在一定程度上會削弱疫苗免疫效力。

陳薇團隊使用一種減毒的普通感冒病毒 (腺病毒Ad5)將編碼SARS-Co V-2 S蛋白的遺傳物質傳遞給細胞,隨后這些細胞分泌S 蛋白并刺激機體免疫系統產生抗體[19]。Ad5載體疫苗是第一個在人體上進行試驗的SARS-Co V-2疫苗,Ⅰ期臨床試驗主要評估該疫苗的安全性及免疫原性,在108名18～60歲健康成人中進行不同劑量的單次肌肉注射,部分受試者表現出輕度或中度的不良反應,發生率為75%～83%。常見的不良反應包括注射部位輕度疼痛(54%,58/108)、發熱 (46%,50/108)、乏力 (44%,47/108)、頭痛 (39%,42/108)和肌肉痛 (17%,18/108),這些不良反應均可在48 h內自行恢復。在接種疫苗后第2周,所有劑量組都檢測到一定水平的受體結合域(receptor binding do main,RBD)特異性抗體,部分受試者體內可檢測到中和抗體 (低劑量組28%,10/36;中劑量組31%,11/36;高劑量42%,15/36),到第4 周中和抗體滴度出現了4倍增長,表明Ad5載體疫苗可以誘導一定程度的體液免疫反應。同時在高劑量組和中劑量組均檢測到脾臟細胞釋放的高水平γ-干擾素,意味著其同時可誘導較強的T 細胞免疫反應。在Ⅱ期臨床試驗中擴大樣本量,入組508名受試者,并且由于COVID-19的重癥率、病死率隨年齡增長顯著升高,Ⅱ期臨床試驗設計重點關注年長人群,最年長的84歲受試者也產生了較為理想的保護性抗體[20]。目前該疫苗已在全球三大洲五個國家的78 家臨床研究中心開展了全球多中心Ⅲ期臨床研究,在巴基斯坦的Ⅲ期臨床試驗中,單針接種疫苗28 d后,COVID-19重癥病例保護效力達到100%,總體保護效力為74.8%。該疫苗采用單針免疫程序,可于2～8 ℃穩定保存,更易于運輸和存儲,在我國已獲國家藥品監督管理局附條件批準上市。

英國牛津大學Folegatti等[21]同樣使用腺病毒作為載體開發了AZD1222 (Ch Ad Ox1 n Co V-19)病毒載體疫苗,裝載編碼全長S蛋白遺傳物質。該試驗共招募了1 077名18～55歲健康成人,其中543 名接種AZD1222 作為免疫組,534名接種腦膜炎共價疫苗Men ACWY 作為陽性對照組,2組均單次肌肉接種5×1010病毒顆粒;在免疫組中隨機選取10例進行初免-加強免疫試驗。該研究發現單次肌肉接種后體內產生S蛋白特異性T 細胞免疫反應,并在第28天達到高峰,初免-加強組T 細胞免疫反應高峰持續升高至第56天。在體液免疫反應監測中發現單次接種后第56 天,62%的受試者體內中和抗體可誘導產生完全抑制細胞病變效應;而10例接受初免-加強免疫受試者均可誘導產生完全抑制細胞病變效應。該研究表明在人體加強免疫能大大提高疫苗免疫效果,同時預防性使用非甾體解熱鎮痛藥能夠緩解疫苗接種引起的發熱、疼痛、肌肉酸痛等輕、中度不良反應[21]。除了腺病毒載體,目前中國香港大學微生物學系以流感病毒為載體的噴鼻式疫苗正在基礎研制中;武漢博沃生物科技有限公司和Geo Vax Labs共同研發基于改良型痘苗病毒安卡拉株為載體的MVA-VLP疫苗[22];美國Tonix公司正在開發基于馬痘疫苗為載體的TNX-801 (經皮注射馬痘病毒活疫苗)[23];法國巴斯德研究所正在研制以麻疹疫苗為載體的SARS-Co V-2疫苗。

4 核酸疫苗 (mRNA疫苗和DNA疫苗)

核酸疫苗屬于目前最尖端的疫苗技術,其將含有編碼抗原組分的mRNA 或DNA 直接或間接接種到受試者體內,通過受試者自身的蛋白表達系統合成抗原蛋白,最終到達細胞膜表面誘發針對該抗原的細胞免疫及體液免疫。DNA 疫苗具有制備簡單快速的優勢,但存在DNA 整合到宿主基因組的潛在安全性問題;而mRNA 不會整合到宿主基因組中,安全性更高,但其穩定性欠佳,如何有效進入人體細胞內并且不被分解是目前的技術難題。

美國國立過敏與傳染病研究所正在研究的mRNA-1273是一種新型脂質納米顆粒封裝的mRNA 疫苗,編碼一種預融合穩定狀態的S蛋白[24]。研究團隊共招募了45名18～55歲的健康志愿者,間隔28 d接受2次肌肉接種,超過一半的志愿者在首次接種后會出現疲勞、發冷、頭痛、肌肉酸痛等自發性不良反應,但這些癥狀都屬輕度或中度,并且是暫時性的,可自行恢復。志愿者在接種第一劑疫苗后體內便會產生抗體,疫苗接種劑量越大其抗體滴度越高,但要在接種第二劑疫苗后才能表現出顯著的免疫反應。研究者進一步通過偽病毒中和測定法和實時噬菌斑減少中和試驗以評估抗體的中和活性[25]。目前mRNA-1273的Ⅱ期臨床試驗已完成,增加劑量至100μg,同時受試者年齡范圍擴大至18～55歲、56～70歲及大于70歲人群后均得到較為滿意的實驗結果[26]。

英國帝國理工大學Shattock 團隊開發了自放大RNA納米疫苗[27]。自放大RNA 是將病毒復制酶基因與S蛋白基因連接,在脂質納米顆粒的遞送下實現RNA 擴增的一種技術,這種脂質載體包裹RNA 的治療方案由Gar ber[28]研究并獲批,開創了脂質納米顆粒-RNA 臨床治療安全性的先例。僅使用病毒的復制酶基因并不包含結構基因,不會產生病毒顆粒,具有較好安全性,但機體仍可能對復制載體產生免疫應答,因此就需要用脂質載體進行包裹模擬細胞膜結構,避免被機體免疫系統清除,同時提高免疫活性。研究人員通過雙劑 (d0/d28)肌肉注射免疫小鼠,產生的Ig G1/Ig G2a抗體比例顯示其主要誘導Th1型免疫應答,在小鼠血清中可觀察到劑量依賴性特異性Ig G,最高達到105～106μg/L,通過假病毒中和實驗進一步證明該疫苗誘導產生的抗體比恢復期人類血清具有更高的活性及保護效力。

Mulligan等[29]合作研發的核酸疫苗 (BNT162b1)已經完成Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗,BNT162b1編碼S蛋白的RBD,是一種脂溶性顆粒型核苷修飾mRNA 疫苗,通過添加T4纖維蛋白衍生的 “foldon”修飾,BNT162b1 表達的RBD抗原為三聚體化RBD,可以有效增強其免疫原性。通過肌肉注射雙劑 (d0/d21)免疫小鼠,注射部位輕度至中度疼痛是最常見的局部反應,且呈現劑量依賴性,短時間內可自行恢復。該Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗共納入36名18～56歲志愿者,驗證了該疫苗可誘導有效的體液免疫反應,加強免疫后血清抗體滴度可達恢復期人類血清的1.8～2.8倍。Walsh等[30]在此基礎上進一步研究對比BNT162b1和BNT162b2(編碼全長S蛋白)的安全性和免疫原性,納入196名18～55歲和65～85歲健康成人,結果表明這兩種候選疫苗具有相似的免疫原性,能夠在體內產生劑量依賴性中和抗體滴度,而且BNT162b2的全身性不良發生率和嚴重程度均低于BNT162b1,尤其在高齡人群中較為明顯。后續將更進一步開展Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗進一步評估BNT162b2的安全性和有效性。

INO-4800是美國生物技術公司Inovio研發的DNA 候選疫苗[31],使用手持式智能設備CELLECTRA 從肌內或皮內將優化后的質粒經過一個簡短的電脈沖,進入細胞并借助質粒DNA 來產生靶抗原,抗原進一步在細胞內自然加工觸發細胞免疫和體液免疫反應。該DNA 疫苗的Ⅰ期臨床試驗招募40名18～50歲的健康成年人,在完成接種的36名受試者中有94% (34名)對接種疫苗產生免疫反應,觀察至接種疫苗后第8周INO-4800展現出良好的安全性和耐受性,且試驗中發生的所有不良事件均為輕度,大多數情況是注射部位發紅。后續INO-4800的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗正在籌備中。

5 重組亞單位疫苗

亞單位疫苗由純化的重組蛋白構成,選擇病毒中目標抗原組分來制備疫苗,其不含病毒復制需要的核酸,因此安全性較高。與病毒載體疫苗的區別在于亞單位疫苗的合成與表達均在體外完成,其具有單純的蛋白組分,可以通過鼻腔或口腔接種進一步誘導黏膜免疫反應,從而更有效地阻斷病毒通過呼吸道傳播,然而作為一種非內生抗原,亞單位疫苗不能通過MHC-Ⅰ遞呈,因此其細胞免疫原性相對較弱,常需要合適的免疫佐劑共同發揮作用,提高其免疫原性。

RBD319-545疫苗是由四川大學科研團隊開發,研究人員使用S蛋白的多個不同部位制備多款候選疫苗,篩選后選定RBD 中編號為319～545的一段氨基酸序列作為候選疫苗[32]。使用該疫苗單劑免疫7 d或14 d后,在小鼠、兔子和獼猴體內誘導有效體液免疫反應,免疫動物的血清在體外可阻斷RBD 與細胞表面ACE2 結合,并中和SARSCo V-2假病毒和SARS-Co V-2活病毒的感染。四川三葉草生物制藥有限公司采用其獨有的Tri mer-Tag (蛋白質三聚體化)專利技術和基因重組的方法構建 “S-三聚體”重組蛋白疫苗基因表達載體,通過基因轉染在哺乳動物細胞內表達、純化,獲得與冠狀病毒天然表面抗原S蛋白構象高度相似的共價三聚體重組抗原 “S-三聚體”。該候選疫苗將使用疫苗佐劑系統和美國Dynavax公司的Cp G 1018 佐劑進行評估,全球Ⅱb/Ⅲ期疫苗有效性研究已進入準備階段。

高福研究團隊為了最大化RBD 結構域免疫原性,構建了RBD 的二聚體抗原,晶體結構顯示二聚化的RBD 完全暴露了雙受體結合基序,這也是中和抗體的主要結合靶標[33]。其研究團隊通過進一步結構導向設計產生穩定的串聯重復單鏈——RBD-sc-di mer,成功保留了疫苗的免疫效力。該疫苗成功在小鼠模型中誘導產生高濃度的中和抗體,保護小鼠免受中東呼吸系統綜合冠狀病毒感染,并進一步將該疫苗設計策略推廣到嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒、SARS-Co V-2的疫苗研發中,為冠狀病毒疫苗的研發提供了新的思路。高福院士表示:該疫苗設計策略靈活易變,可普遍應用于其他β屬冠狀病毒疫苗的設計中,從而應對未來可能出現的由冠狀病毒引起的新型傳染病。

美國Novavax 公司研制的重組亞單位疫苗NVXCo V2373是一種穩定的預融合重組蛋白疫苗[34]。它是利用基因工程使用昆蟲細胞生產的SARS-Co V-2 S糖蛋白,由該公司自主研究開發的納米顆粒技術制成。Tian 等[35]和Guebre-Xabier等[36]分別在小鼠和獼猴體內評估該疫苗的免疫原性及保護效力,結果表明低劑量 (5μg)的VXCo V2373雙劑肌肉接種后便可產生較高水平S蛋白特異性抗體,同時可以阻斷RBD 與ACE2結合。該疫苗的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗首先在墨爾本阿爾弗萊德醫院展開,131 名年齡在18～59 歲的健康志愿者報名參加了這項試驗。Novavax表示,該試驗的第二階段預計將在包括美國在內的多個國家進行,評估更廣泛年齡段參與者的免疫原性、安全性,以及降低COVID-19 疾病傳播的可能性。此外,美國生物制藥公司i Bio 和北京CC Phar ming 有限公司合作,利用Fast Phar ming Syste mTM植物工廠生產亞單位疫苗以應對SARS-Co V-2,該疫苗目前正在加速研發中。

6 總結與展望

SARS-Co V-2多種候選疫苗具有較好的安全性、耐受性和免疫原性。滅活病毒疫苗現已有序推進廣泛接種,Ⅲ期臨床試驗數據表明其保護效力為79.34%,遠高于WHO提出的不低于50%的標準,為SARS-Co V-2疫苗的進一步研發和臨床應用提供了重要信息。

在SARS-Co V-2快速傳播及藥物選擇背景下,病毒基因組結構發生變異。盡管S蛋白相對穩定,個別位點的突變對蛋白本身結構的影響較小,但病毒基因的不斷變異一定程度上限制了SARS-Co V-2 疫苗的研制。因此,后續SARS-Co V-2疫苗的設計研發策略需要進一步調整,利用基因組學、分子生物學等技術設計更加成熟、穩定的疫苗,向著更加精準、長期、高效的為機體提供免疫保護效力發展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突