發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的控制技術(shù)研究進(jìn)展

王馨蕊，湯回花，劉畢琴，陳駿飛，趙 楠，史 巧*，李 宏

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650000；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610000）

發(fā)酵是蔬菜的主要加工方法，中國(guó)具有地方特色的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品豐富多樣，年加工量較大。亞硝酸鹽是發(fā)酵蔬菜中主要的有害代謝產(chǎn)物，其引發(fā)的高鐵血紅蛋白癥及在機(jī)體內(nèi)形成致癌物亞硝胺會(huì)對(duì)人體健康造成較大危害。在蔬菜發(fā)酵過程中，有害代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽有逐漸上漲的趨勢(shì)，積累量達(dá)到最大時(shí)稱為亞硝峰，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，亞硝酸鹽又逐步緩慢降低。中國(guó)對(duì)腌漬蔬菜中的亞硝酸鹽含量已有限量標(biāo)準(zhǔn)，通過延長(zhǎng)發(fā)酵周期保證產(chǎn)品中亞硝酸鹽不超過規(guī)定范圍的方法已不能適應(yīng)現(xiàn)代企業(yè)及消費(fèi)市場(chǎng)需求。現(xiàn)有發(fā)酵蔬菜加工企業(yè)通過延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間來確保產(chǎn)品中亞硝酸鹽在限量范圍內(nèi)的方法，很大程度上加長(zhǎng)了企業(yè)的生產(chǎn)周期，不利于加工企業(yè)更加高效的運(yùn)轉(zhuǎn)。此外，為適應(yīng)消費(fèi)者需求開發(fā)的快速發(fā)酵蔬菜新產(chǎn)品，由于發(fā)酵時(shí)間很短，不能確保產(chǎn)品已越過亞硝峰，快速發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽殘留量問題也不容忽視。為了發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)向更加健康、營(yíng)養(yǎng)的方向快速發(fā)展，研究發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽控制技術(shù)十分必要。

1 食品中亞硝酸鹽的危害及限量

在蔬菜發(fā)酵初期酸性環(huán)境尚未形成，具有硝酸鹽還原作用的雜菌將蔬菜中大量硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，使產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量急劇升高。亞硝酸鹽是一種強(qiáng)毒性物質(zhì)，成年人一次性攝入3 g即可致死，其對(duì)人體造成的危害，主要包括引起高鐵血紅蛋白癥以及在人體內(nèi)形成致癌物質(zhì)亞硝胺[1]。過多攝入的亞硝酸鹽使紅細(xì)胞亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致全身出現(xiàn)缺氧反應(yīng)，高鐵血紅蛋白在體內(nèi)達(dá)到70%以上時(shí)將導(dǎo)致死亡。亞硝酸鹽的長(zhǎng)期攝入還會(huì)引起維生素A缺乏癥[2]。由亞硝酸鹽引起的胎兒和嬰兒組織性缺氧，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。亞硝酸鹽本身并不會(huì)直接引起人體癌變，但在有仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸存在的如胃液等酸性環(huán)境（pH值2～4）中，可生成具有強(qiáng)烈致癌作用的N-亞硝胺類化合物，這類物質(zhì)可導(dǎo)致食道癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生，飲食中存在過量亞硝酸鹽的地區(qū)常常是消化系統(tǒng)癌癥的高發(fā)地[3]。亞硝胺引起的DNA烷化還具有致畸性，母體過量攝入亞硝酸鹽將可能導(dǎo)致胎兒畸形。

食品中的亞硝酸鹽已引起人們足夠的重視，經(jīng)過聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑委員會(huì)的數(shù)次修訂，在2002年亞硝酸鹽的每日允許攝入量（ADI）被建議為每千克體重0～0.07 mg。此外，歐共體建議嬰兒食品中不得使用亞硝酸鹽。中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》GB2762—2017中規(guī)定，腌漬蔬菜亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）不超過20 mg·kg-1。中國(guó)《綠色食品 醬腌菜》標(biāo)準(zhǔn)（NY/T437—2012）中規(guī)定亞硝酸鹽（NaNO2計(jì)）≤4 mg·kg-1。

2 研究發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽控制技術(shù)的必要性

大多數(shù)發(fā)酵蔬菜企業(yè)通過延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間來控制產(chǎn)品中的亞硝酸鹽含量，市場(chǎng)上正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品亞硝酸鹽含量基本在限量范圍內(nèi)。但由于加工原料蔬菜不同、發(fā)酵環(huán)境溫度不定等原因，亞硝酸鹽超標(biāo)現(xiàn)象仍然存在。有研究者對(duì)20種市售泡菜的亞硝酸鹽含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)55%的樣品存在超標(biāo)問題，其中白菜（74 mg·kg-1）、蘿卜（32 mg·kg-1）及黃瓜（25 mg·kg-1）的亞硝酸鹽平均含量均超過了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，成都市的發(fā)酵菠菜亞硝酸鹽含量超標(biāo)率達(dá)73.3%，含量最高的超過了150 mg·kg-1[1]。不同蔬菜發(fā)酵過程中亞硝峰出現(xiàn)的時(shí)間及峰值存在差異，李海麗對(duì)發(fā)酵芹菜、萵筍、大白菜及白蘿卜等做了研究，發(fā)現(xiàn)第5 d時(shí)除萵筍和芹菜外，亞硝酸鹽殘留量均達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)，芹菜發(fā)酵至第11 d依然高于20 mg·kg-1[5]。張雁等發(fā)現(xiàn)4個(gè)品種的芥菜在20℃、4%鹽濃度下自然發(fā)酵，都在第1 d出現(xiàn)亞硝峰，其中3種芥菜均低于國(guó)標(biāo)，但水東芥菜峰值達(dá)到36.39 mg·kg-1[6]。亞硝峰出現(xiàn)時(shí)間跟環(huán)境溫度高低有關(guān)，5%鹽濃度下，35℃、26℃環(huán)境中發(fā)酵的白菜在第3 d出現(xiàn)亞硝峰（約40 mg·kg-1），20℃在第4 d出現(xiàn)亞硝峰（約50 mg·kg-1），10℃下第6 d才出現(xiàn)亞硝峰（約60 mg·kg-1）[1]。由于季節(jié)等原因，發(fā)酵環(huán)境溫度越低，有可能亞硝峰出現(xiàn)越晚，峰值越大，殘留量超標(biāo)的可能性也相應(yīng)增加。受蔬菜品種及氣溫的影響，生產(chǎn)自然發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的企業(yè)在通過延長(zhǎng)發(fā)酵周期來降低亞硝酸鹽殘留量的過程中，大量的資金往往停留在了這一環(huán)節(jié)，對(duì)企業(yè)的運(yùn)轉(zhuǎn)造成了巨大壓力。一些地區(qū)為了追求發(fā)酵蔬菜爽脆的口感，往往在接近亞硝酸鹽峰值的時(shí)間食用發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品，對(duì)健康造成了一定的風(fēng)險(xiǎn)。探索降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的有效方法，將幫助發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)企業(yè)緩解資金周轉(zhuǎn)問題、創(chuàng)造更大效益，同時(shí)滿足大眾對(duì)發(fā)酵蔬菜口感的需求，降低亞硝酸鹽可能對(duì)人體健康造成的傷害。

3 發(fā)酵蔬菜亞硝酸鹽控制技術(shù)

3.1 通過有機(jī)酸控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

有機(jī)酸具有一定的還原性，發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的降解可能與有機(jī)酸的這一特性有關(guān)。蔬菜本身含有一定量的草酸、抗壞血酸及乙酸等多種有機(jī)酸，乳酸作為乳酸菌的代謝產(chǎn)物，蔬菜發(fā)酵后也會(huì)積累一定的量。有研究表明草酸、酒石酸和乳酸等均能降解泡菜中的亞硝酸鹽，有機(jī)酸初始濃度越高，降解率越高，草酸降解亞硝酸鹽的效果最明顯[7]。有機(jī)酸降解亞硝酸鹽的途徑也有研究者做了相應(yīng)的研究，抗壞血酸具有一個(gè)強(qiáng)還原性的烯二醇基團(tuán)，其通過減慢硝酸鹽還原和增快亞硝酸鹽脫氮等方式達(dá)到減少亞硝酸鹽積累的效果[8]。龐杰等發(fā)現(xiàn)在醬菜中添加0.04%抗壞血酸，即可阻斷72.33%的亞硝酸鹽生成[9]。檸檬酸有2條途徑減少亞硝酸鹽，一條途徑是通過檸檬酸與亞硝酸鹽作用生成HNO2，由于HNO2極不穩(wěn)定，將繼續(xù)分解為NO；另一條途徑是通過檸檬酸解離出的H+，使NO2-還原為NH4+[10]。

3.2 通過酶控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NiRs）能夠?qū)喯跛猁}降解為NO或NH3，是一種存在于高等植物、藻類植物和許多微生物中的胞內(nèi)酶。蔬菜發(fā)酵中的亞硝酸鹽能夠被乳酸菌代謝產(chǎn)生的NiRs還原，理論上將NiRs提純后添加于發(fā)酵蔬菜中即可降低亞硝酸鹽含量。提取和制備活性酶制劑的方法雖然已有一些報(bào)道，但NiRs在胞外作用的效果還不夠理想，離實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還需要更深入的研究。JOSE等將衣藻中的鐵氧化還原蛋白-亞硝酸鹽還原酶固定化，發(fā)現(xiàn)這種方法增加了酶體系在溫度和離子強(qiáng)度方面的穩(wěn)定性，但酶活力有所降低[11]。國(guó)內(nèi)研究者通過紫外誘變產(chǎn)NiRs菌株、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法，提高菌株產(chǎn)酶能力，純化后的酶有一定的降低超標(biāo)食品中亞硝酸鹽的效果[12]。這些工作為后續(xù)酶法控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量相關(guān)研究做了鋪墊，但酶的穩(wěn)定性、安全性等方面問題還需要更加深入、全面的研究。

3.3 通過其他物質(zhì)控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

發(fā)酵蔬菜中添加的香辛料能一定程度上減少亞硝酸鹽積累，如姜油酮等成分可以阻止硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；大蒜、大蔥和洋蔥中富含的巰基化合物能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成其他化合物，減少亞硝酸鹽積累[13]。植物提取物如茶多酚、二氫楊梅素等，以及一些富含黃酮類、多酚類化合物的真菌提取物，可以通過抗氧化性或協(xié)同作用來降低發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽[5]。如茶多酚可以保護(hù)發(fā)酵蔬菜中的抗壞血酸，促進(jìn)抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽的清除[14]。原花青素能夠在有亞硝酸鹽存在的酸性緩沖溶液中，將亞硝酸還原并生成NO[15]。糖類物質(zhì)也有降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的作用，研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、杜仲多糖及殼聚糖等均能有效減少亞硝酸鹽含量[16]。

3.4 通過接種乳酸菌控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

利用乳酸菌來控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽主要是通過其代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶、乳酸等有機(jī)酸以及乳酸菌素等抑菌物質(zhì)發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)。發(fā)酵初期，pH值在4.5以上時(shí)，亞硝酸鹽的降解主要通過乳酸菌的胞內(nèi)亞硝酸鹽還原酶來實(shí)現(xiàn)；當(dāng)pH值降至4.0以下，則通過大量積累的乳酸來降解亞硝酸鹽；而乳酸菌素等可以抑制具有硝酸鹽還原酶活性的腐敗菌、病原菌生長(zhǎng)，從而減少產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量。在待制作的發(fā)酵蔬菜中人工接種乳酸菌，乳酸菌本身不產(chǎn)生亞硝酸鹽，還能夠有效降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的殘留量[17]。乳酸菌素具有耐酸耐低溫、降解少的特性，適合開發(fā)為生物防腐劑，ADAMS等認(rèn)為乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸菌素、有機(jī)酸、雙乙酰及過氧化氫等物質(zhì)能夠起到抑菌作用[18]。純?nèi)樗峋l(fā)酵生產(chǎn)周期快，產(chǎn)品亞硝酸鹽含量低，在賦予發(fā)酵蔬菜風(fēng)味的同時(shí)，乳酸菌的益生作用也改善了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，符合現(xiàn)代人們對(duì)健康飲食的需求。

3.5 通過原料、工藝控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽

原料是影響發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量的主要因素之一，控制好原料蔬菜品質(zhì)，將可有效控制產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量。選擇沒有過度施肥、管理得當(dāng)、抗壞血酸含量高的蔬菜品種是發(fā)酵加工前的良好保障。此外，還需注意蔬菜采后的儲(chǔ)藏、運(yùn)輸管理，保證原料新鮮、完好[14]。在實(shí)際生產(chǎn)中，除了原料外發(fā)酵蔬菜的亞硝酸鹽含量受多種因素影響，通過消毒器皿、調(diào)節(jié)食鹽濃度、發(fā)酵溫度、起始pH值等方法，能一定程度上減少亞硝酸鹽產(chǎn)生。發(fā)酵初期，沒有達(dá)到乳酸菌生長(zhǎng)最佳環(huán)境條件，乳酸積累較少，主要通過食鹽發(fā)揮抑菌作用，對(duì)食鹽耐受力差的微生物在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制，從而使硝酸鹽還原過程減緩。但鹽濃度增加到一定量后將抑制乳酸菌的活動(dòng)，所以傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的腌制鹽濃度一般在5%～10%[5]。在25～30℃條件下乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，硝酸鹽還原酶陽性菌的活動(dòng)在酸性條件下受到抑制，同時(shí)大量積累的乳酸能將已生成的亞硝酸鹽分解。由于高酸度環(huán)境能抑制大腸桿菌等有害微生物，同時(shí)加速亞硝酸鹽的降解，添加醋酸等物質(zhì)降低發(fā)酵起始pH值，也能夠有效減少亞硝酸鹽含量[19]。由于硝酸鹽還原酶陽性菌生長(zhǎng)一般需要氧氣，而乳酸菌偏好厭氧環(huán)境，發(fā)酵過程中減少容器中的氧氣含量也有助于減少亞硝酸鹽，因此加工時(shí)需將蔬菜壓實(shí)，發(fā)酵液淹沒菜體，壇沿加水隔絕空氣。

4 小結(jié)

中國(guó)制作發(fā)酵蔬菜已有幾千年的歷史，在蔬菜加工產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。控制發(fā)酵蔬菜中有害代謝產(chǎn)物，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全，對(duì)于該產(chǎn)業(yè)更加健康、長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展非常關(guān)鍵。發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量受原料類型、環(huán)境溫度等因素影響，要控制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽不能一概而論。根據(jù)企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，綜合運(yùn)用現(xiàn)有技術(shù)手段，將是規(guī)模化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)低亞硝酸鹽發(fā)酵蔬菜的可循之徑。