機械刺激對牙周骨組織工程干細胞分化的影響

李天樂， 常欣楠， 仇旭童， 付笛， 張陶

口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院，四川 成都（610041）

牙周骨組織工程是指運用組織工程的方法來恢復受損或缺失的牙周骨組織，包含牙骨質和牙槽骨等復雜組織結構的重建［1］。目前，利用種子細胞合并支架材料和生物因子已能夠成功修復大尺寸的組織缺陷［2］。然而，由于牙周骨組織中牙槽骨和牙骨質等結構的硬度及空間結構有明顯差異，支架材料的不同機械性能對干細胞的增殖、分化等生物學行為具有不同誘導作用。因此，需根據每個特定組織或器官的特異性，對生物支架進行個性化制備，從而增強種子細胞的附著和存活，改變其形態，引導種子細胞發生特定的功能性分化［3］。目前，根據不同組織的結構和力學特征的差異性，可通過調整支架材料的基質硬度［4-7］和基質拓撲結構［8］等機械刺激因素為間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）［9］、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）［10］等種子細胞提供合適的生長環境，促使其細胞骨架網絡發生改變，利于其向特定方向發生分化。本綜述概述了在牙周骨組織工程研究中，支架材料基質硬度、拓撲結構等機械刺激因素對種子細胞生物學行為的影響，期望通過調控支架材料的硬度和結構等性能，以還原細胞在牙周骨組織重建時的生理狀態，提高骨組織重建的成功率，旨在為口腔相關骨組織的修復與重建提供新思路。

1 支架的基質硬度對牙周骨組織工程干細胞增殖分化的影響

不同機體組織中細胞所處的微環境不盡相同，細胞外基質硬度隨基質成分的改變而具有較大差異。例如，膠原骨的硬度為25～40 kPa，腦組織的硬度相對較小為0.1～1.0kPa。由此可見，組織硬度與組織和細胞的功能表達具有密切聯系［11-14］。研究表明，隨著基質硬度增加，細胞可持續地從硬度較低向硬度較高的方向遷移，且遷移速度逐漸降低，增殖加快，細胞的黏附性增強，提示細胞外基質的硬度對細胞的定向運動有一定影響［15］。隨著聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAAM）凝膠硬度由95 Pa 增至4.3 kPa，成纖維細胞遷移速度由0.81 μm/min 明顯降低至0.38 μm/min。當基質硬度從4.7 kPa 增至14 kPa 時，小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3 在24 h 和48 h 后細胞增殖量分別達到硬度增加前的2 倍和4 倍。此外，基質硬度可通過調控TGF-β 的表達來調控細胞的凋亡，相對于硬度較高的細胞外基質，硬度較低的底物中細胞凋亡數量明顯增加［16］。

基質硬度還可調控牙源干細胞的分化方向。將MSCs 培養于不同彈性模量的基質上發現，干細胞可分化為軟骨細胞、成骨細胞和神經元細胞等，較軟的基質促使干細胞向神經分化，而較硬的基質更傾向于促使干細胞向成骨分化，介于軟硬兩者之間的基質硬度促進干細胞向成肌分化。MSCs接種在具有硬度梯度的基質表面時，細胞向硬度較高的區域遷移，且分化方向受硬度調控［17］：腦（0.1～1 kPa）、肌肉（8～17 kPa）、膠原骨（25～40 kPa），其機制可能是MSCs 通過細胞骨架重構，產生多種轉導蛋白，從而誘導其基因表達發生變化［18］。在具有生物相容性和可生物降解的聚天冬酰胺（poly aspartamide，PASP）的水凝膠上培養牙周膜細胞（periodontal ligament cells，PDLCs），并根據基質硬度的變化檢測其活性和分化能力。當基質硬度為0.1～1 kPa 的軟凝膠時，PDLCs 向神經源性分化，而當基質硬度升高至8～17 kPa 時，PDLCs 向肌源性分化。對于細胞向成骨分化，基質硬度為最強的25～40 kPa 最合適；并且該實驗還發現在含有游離硫醇基團的PASP 凝膠上能增強細胞活性，進一步促進了PDLCs 向成骨分化［19］。整聯蛋白α5/β1 位于細胞表面，并參與hMSCs 的成骨分化過程。研究發現在13～16 kPa 的培養基上培養時，hMSCs 呈橢圓形、脂肪細胞樣外觀；而在62～68 kPa 培養基上培養時，整合素α5/β1 和Wnt/βcatenin 下游分子的蛋白質表達增加。因此62～68 kPa 的基質硬度能夠通過整合素α5/β1 和Wnt 通路影響細胞內信號傳導，進而促進hMSC 的成骨能力［20］。

基質硬度對干細胞成骨誘導機制的研究主要集中于Yes 相關蛋白/轉錄共激活因子PDZ 結合基序（Yes-associated protein/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，YAP/TAZ）。YAP/TAZ 絡合物主要通過以下兩種途經調節細胞的機械敏感性：①Hippo 途徑，其中鈣粘蛋白和反式鈣粘蛋白相互作用導致YAP 被隔離在細胞質中；②機械敏感的途徑，其中細胞骨架張力促進YAP 核易位和下游轉錄活動［21］。這兩種途徑共同調控YAP/TAZ絡合物的定位，在較軟的水凝膠或可變形的纖維材料上，YAP 存在于胞質中，而在堅硬的水凝膠上時，細胞響應骨架拉伸導致YAP 定位于細胞核［22］。細胞核中的YAP 和TAZ 蛋白，它們與DNA結合伴侶（即TEAD 轉錄因子家族的成員）相互作用，以調節基因轉錄，從而調控細胞的分化方向［23］。對分子-細胞相互作用的研究顯示重組核纖層蛋白-A（lamin-A）水平受到視黃酸（retinoic acid，RA）途徑的協同調節，基質剛度的增加和核纖層蛋白-A 表達促進RA 受體-γ 的核蓄積增加，而RA 拮抗藥的使用可增強核纖層蛋白-A 的基因上調，進而促進干細胞的成骨分化［24］。

目前越來越多的研究已不僅僅局限于靜態的基質硬度對細胞的影響，還將動態基質硬度引入，探究干細胞對局部微環境剛度變化的響應。大量研究都發現細胞可以保留來自過去培養環境中的硬度信息，并影響細胞未來的分化方向，即機械記憶。Peng 等［25］將MSCs 先后在兩個不同硬度的基質上培養，發現在高硬度基質（30 kPa）上培養時，根據培養時間由長到短依次分化為成骨細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞以及神經原細胞。隨后將高硬度基質上的MSCs 接種到低硬度基質（0.9 kPa）上，結果發現保留機械記憶的MSCs 在低硬度基質上依次分化為成骨細胞和心肌細胞；但當低硬度基質的硬度再次上升到12 kPa 后，僅觀察到分化為成骨細胞的MSCs 依舊保留著機械記憶；由此可推斷，MSCs 機械記憶的保留，與MSCs 所在基質的硬度以及培養時間呈正相關［25］。有學者將MSCs培養于基質硬度在5～100 kPa 范圍內動態變化的藻酸鹽基水凝膠上，進一步研究了機械記憶的作用，結果發現硬化的水凝膠（由軟變硬）早期會抑制MSCs 的成骨分化，而軟化的水凝膠（由硬變軟）早期仍能促進了MSCs 的成骨分化，說明了MSCs能夠在動態環境中建立機械記憶并影響未來的成骨分化，該過程還被證明了可能與miRNA-21 對機械信號的調節有關［26］。有學者設計了一款具有光響應性能夠進行基質硬度轉換的透明質酸水凝膠，MSCs 在最初的硬基質上表現出擴展的形態和YAP/TAZ 在細胞核的定位，隨后MSCs 形態的延伸程度和核YAP/TAZ 的含量伴隨著基質軟化和硬化先降低后升高，結果表明MSCs 形態和YAP/TAZ 易位響應基質剛度的過程是可逆的［27］。

2 支架的拓撲結構對牙周骨組織工程干細胞成骨分化的影響

基質的拓撲結構是指基質的形狀、尺寸和細胞的點陣排布，目前有研究表明納米級空間結構對細胞的表觀狀態、分化方向等均有影響［8］。在基質硬度的基礎上，Yang 等［28］探究了拓撲結構對干細胞的影響，在具有較硬（約10 kPa）水凝膠上培養的MSCs 表現出更大的擴散面積和核YAP 積累。但是在比較硬水凝膠表面規則圖案和隨機圖案對MSCs 的成骨影響時卻發現，規則圖案化凝膠上的細胞分布更廣，成骨標記ALP 的表達更高，并且隨機圖案化凝膠和軟水凝膠上培養的MSCs 成骨分化可能受CD105 表達的抑制。一項有關基質形狀對成骨分化影響的研究將MSCs 在圓度為1 的圓和圓度為0.1 帶有矩形分支的圓上培養，并且對于一種類型的圖案，又分別設置面積為314 μm2、628 μm2，1 256 μm2和2 512 μm2的培養基。結果發現MSCs 在帶有矩形分支的圓上的成骨性明顯高于單純的圓形，并且較大的擴散面積（即2 512 μm2）提高了MSCs 的存活率。其原因是較大的擴散面積增加了核面積，促進了YAP 的核定位，進而增強了MSCs 的成骨分化［29］。又有實驗通過設置寬度為700 nm，柱間距分別為1.2、2.4、3.6 和5.6 mm 的納米柱，發現不同密度的納米柱可影響MSCs 的分化方向。其中納米柱之間的距離越大越有利于成骨分化，距離越小越有利于脂肪形成；可能是由于細胞骨架活性的b1 整聯蛋白、b3 整聯蛋白和F-肌動蛋白的表達上調，觸發了細胞骨架重組，增加了細胞硬度，從而促進其成骨分化［30］。在納米微孔方面，有學者設計了一款膠原蛋白海綿用于大鼠顱骨缺損的修復。該海綿是由（32.97±1.41）nm 的納米孔與（60.66 ± 24.48）μm 的微米孔共同構成，MSCs能夠通過微孔遷移到海綿中，進而被海綿中的納米孔誘導成骨分化，發現該結構即使在不添加任何細胞或生長因子的條件下，其獨特的納米和微觀形貌也能在體內驅動膜內骨化和顱骨修復［31］。

除了表觀納米級形狀可誘導MSCs 成骨向分化外，不同尺寸和排列的點陣序列可以調控細胞的生物學行為。在不同直徑的納米管和雙層蜂窩結構的納米管相互比較的實驗中，MSCs 在蜂窩結構的粘著力最強，而較大的納米管（直徑4.51 μm）中的粘著斑顯著大于較小的納米管（直徑3.65 μm 和直徑2.53 μm），MSCs 在較大的納米管和雙層蜂窩結構表面上的形態顯著伸長，其中在蜂窩結構上形成了更長的突起，因而蜂窩結構能夠誘導細胞骨架應力的增強，從而選擇性成骨分化［32］。

最近，還有研究將目光聚焦于三維支架材料，Mao 等［33］將PDLSCs 分別種植在平坦表面、致密表面和納米棒/微棒混合體的生物陶瓷上，在對比后發現PDLSCs 在混合體上附著力更強，細胞質延伸的更明顯，并且細胞的肌動蛋白絲排列規則且平行于細胞的長軸；可能是由于細胞在納米棒和微棒混合體表面的三維結構上時，細胞與生物陶瓷表面之間的接觸面積增加，而PDLSCs 邊緣向三維納米結構的延伸導致細胞形態擴展，附著性增強。該研究進一步發現與對照組相比，在納米棒和微棒混合體組中的成骨特異性轉錄因子（runtrelated transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達在第4 天明顯上升，骨鈣素（osteocalcin，OCN）在第7 天明顯增強。因此，接種在混合體上的PDLSCs 可通過Wnt/βcatenin 信號通路向成骨分化。有學者并未局限于對牙周骨組織修復的研究，還考慮牙骨質-牙周膜-牙槽骨復合物的重建。Liu 等［34］使用三維納米復合水凝膠支架促進牙骨質的形成，從而將細胞和生長因子遞送至兔上頜牙周缺損。該支架有三層：第一層是為牙骨質/牙本質界面設計的100 μm微通道，第二層是為牙周膜設計的600 μm 微通道，第三層是為牙槽骨設計的300 μm 微通道。重組人類釉原蛋白、結締組織生長因子和重組人骨形態發生蛋白2，分別在第一、二和三層中進行了空間傳遞和時間釋放。牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、PDLSCs 和牙槽骨干/祖細胞（alveolar bone stem/progenitor cells，ABSCs）分別在4 周的體外培養后獲得了特定的組織表型。隨后將具有/不具有生長因子FGF-2 的三層納米復合水凝膠支架置于兔上頜牙周缺損中。與單獨使用支架相比，具有生長因子的三層納米支架實現了完全的骨缺損閉合和愈合，形成了新的松質樣組織。并在第3 個月時證實了新牙骨質、纖維狀牙周膜和含有骨小梁的牙槽骨的生成。

盡管已經有許多研究證明了幾十納米至幾微米范圍內的表面形貌顯著影響干細胞的分化，但納米形貌誘導肌動蛋白重組的潛在分子機制仍不清楚。有關拓撲結構誘導細胞分化的機制研究發現納米形貌產生的膜曲率可以被細胞內曲率傳感蛋白識別以激活包括神經Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（neural Wiskott-Aldrich syndrome protein，NWasp）、皮層肌動蛋白和Arp2/3 復合物的下游信號傳導，使分支的F-肌動蛋白成核，進而促進應力纖維組織和粘著斑成熟［35］。在進一步地有關曲率對干細胞成骨分化機制的研究中發現，與光滑形貌和不規則微尺度形貌表面進行比較，帶負電荷的細胞在具有微細溝槽和納米級孔隙的分層微納米形貌上顯示出最高的密度，從而募集更多帶正電荷的錨蛋白來增強細胞粘附。其可能原因是黏著斑構建的最適平均整聯蛋白間隔約為45 nm，而分層微納米形貌的納米孔直徑約為40 nm。表面上均勻分布的納米級特征基本上與整聯蛋白的間隔分布相匹配，因此更有利于形成成熟的粘著斑，提高了細胞粘附性［36］。該研究還進一步表明細胞的PI3K-AKT 信號通路在分層微納米形貌中被激活，并且該通路的激活同時也伴隨著整聯蛋白α2 的高表達。可以推斷，整聯蛋白α2 的強制表達可以激活PI3K-AKT信號傳導途徑，從而促進成骨分化［36］。

3 機械力對牙周骨組織工程干細胞成骨分化的影響

大量體內外實驗及臨床實踐表明，適當的機械力對牙源性干細胞成骨分化、牙槽骨和牙骨質等組織的生長與重建有著密切聯系［37］。在生理條件下、口腔治療過程中及病理狀態下，均存在對牙體組織和牙周組織的機械力?？赏ㄟ^對機械力施加控制，進而改變細胞分泌的信號分子來調控牙源性干細胞的成骨/破骨向分化，誘導牙周骨組織朝著預期的方向進行修復和重建再生［38］。因此只有將機械力與支架材料的性能聯動起來，才能更好地發揮支架材料在植入口腔后的作用。

在牙齒咀嚼和咬合過程中均存在對牙周組織的機械負荷。正常生理條件下，適宜的機械負荷有利于牙周組織的生長及健康。將模擬天然組織環境的機械應力條件與納米纖維基質拓撲結構相結合，發現納米纖維的排列能夠影響PDLCs 在基質上的鋪展和分布。與隨機排列的膠原纖維相比，定向排列的膠原纖維更能增強PDLCs 的成骨分化能力。在PDLCs/納米纖維基質上施加了在生理范圍內的6%應變后，發現隨著機械負荷的增加，PDLCs 的成骨因子表達下降，成骨分化能力減弱，并且PDLCs 的形態由非定向變為定向（雙極），進而能夠垂直排列在無序納米纖維上。提示了在機械力與拓撲結構的聯動作用下，PDLCs 可伴隨著細胞骨架排列方式的變化，調控組織的骨重塑［39］。

缺少重力會對組織發育產生負面影響，導致肌肉和骨骼萎縮，從而造成礦物質攝入減少和礦物質吸收增加、心血管疾病以及血液循環問題［40］。相反，通過離心模擬超重力條件下的細胞培養實驗表明，超重力環境對成骨細胞生成相關基因如骨鈣蛋白、維生素D 受體和Runx2 產生了有利影響［41］。有研究將MSCs在200 nm寬孔距、50 nm深、120 nm 寬的納米溝槽基底上培養，隨后對其進行47 rpm 離心以產生超重力。當兩種刺激結合時，觀察到對細胞增殖的累加效應，并且在培養7 d 后增強了MSCs 的礦化作用以及骨鈣素mRNA 的表達；納米溝槽基底上細胞數量的增加可能與有絲分裂紡錘體的快速排列有關，因為有絲分裂紡錘體纖維從細胞的兩個極點平行地向細胞核延伸，其中紡錘體的平行對齊對于染色體移動和細胞分裂至關重要，所以該過程的加快可以促進細胞的分裂；而細胞在7 d 后的大量礦化可能是由于細胞數量增加，MSCs 在超重力的作用下會增加骨鈣素的表達水平，該水平的增加能夠提高骨礦化的程度和維持鈣離子的穩態，促進了MSCs的成骨表達［42］。

4 總結與展望

牙周骨組織是一種由牙骨質和牙槽骨組成的復雜組織，運用于牙周骨組織工程的支架材料應具備適合細胞附著、增殖和分化的表面結構及與植入部位相匹配的機械性能［43］。然而，現有生物材料的物理性能和空間結構與天然牙周骨組織的匹配程度仍存在差異，牙源性干細胞在移植進入需要修復的組織后常喪失活性，無法如預期啟動成骨相關信號通路進行成骨向分化。并且由于體內外環境存在一定差異，在支架材料攜帶牙源性干細胞植入機體后，還要承受生理條件下機械力所帶來的影響。因此，開發一系列能與天然組織最大化匹配、與生理狀況相適應、并且能與成骨活性因子相結合的支架材料，對增強牙源性干細胞在骨組織修復中的成骨活性尤為必要。

【Author contributions】Li TL, Chang XN, Chou XT, Fu D collected the references and wrote the article, Zhang T revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.