γ-環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)的研究進展

柏玉香，吳浩

1(江南大學，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)是由若干D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖，具有外部親水和內(nèi)部疏水的獨特桶裝結(jié)構(gòu)，可用于增溶、穩(wěn)定客體分子等。自1891年VILLERS的首次發(fā)現(xiàn)，CD在經(jīng)歷了20世紀30年代中期的分離純化，物理化學性質(zhì)表征和20世紀70年代初的毒理學研究后，開啟了其工業(yè)化生產(chǎn)和規(guī)模化應(yīng)用。發(fā)展至今，CD已經(jīng)在食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、紡織和生物技術(shù)等多個領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1]。

根據(jù)2019年QYResearch發(fā)布的行業(yè)研究報告顯示，全球CD市場規(guī)模為1.94億美元。在系列CD產(chǎn)品中，β-CD的銷量最大且市場趨于飽和，而附加值最高的γ-CD的應(yīng)用推廣將有利于市場的進一步釋放。然而γ-CD生產(chǎn)技術(shù)被歐美日等國壟斷，我國無法參與全球生產(chǎn)競爭，這不僅推高了γ-CD 的價格，也制約了其在食品等大體量產(chǎn)品中的應(yīng)用。

1 γ-CD概述

γ-CD由8個葡萄糖單元構(gòu)成，無色、無味、不吸濕，在堿性溶液中非常穩(wěn)定，僅在pH值低于2的酸性介質(zhì)中才會水解，并耐受約280 ℃的高溫。在食品中應(yīng)用時，γ-CD的無致敏性優(yōu)勢突出[2]。3種CD的結(jié)構(gòu)及理化特性如圖1和表1所示。

a-α-CD的化學結(jié)構(gòu)；b-β-CD的化學結(jié)構(gòu)；c-γ-CD的化學結(jié)構(gòu)

表1 α-CD，β-CD和γ-CD的理化特性對比[2-3]

γ-環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)是略呈錐狀的中空圓筒，圓筒內(nèi)腔是由非極性的氫原子和氧原子構(gòu)成的疏水性結(jié)構(gòu)，而圓筒外部由于具有較多的羥基因此表現(xiàn)出強親水性。γ-環(huán)糊精的獨特分子結(jié)構(gòu)將許多疏水性物質(zhì)包合在圓筒腔內(nèi)，從而改善其應(yīng)用效果[4]。在3種常規(guī)CD中，γ-CD具有許多獨特優(yōu)勢，如γ-CD具有最大的空腔直徑，可以包埋許多α-CD、β-CD無法包埋的物質(zhì)；γ-CD具有最高的溶解性，可以最有效地提高客體化合物的溶解能力和乳化能力；此外γ-CD對人體安全性最高，亦可被酶作用，使其易被小腸降解吸收從而減少腎毒性[5]。基于以上優(yōu)勢，γ-CD的應(yīng)用點可以概括為四方面：(1)掩蓋不良氣味；(2)提高生物利用度；(3)控制客體分子釋放速度；(4)提高產(chǎn)品溶解性和穩(wěn)定性[6]。輔酶Q10在線粒體電子傳輸中起重要作用，已經(jīng)用于治療心臟病和退行性疾病。但輔酶Q10是一種脂溶性化合物，人體口服后不能很好的吸收，因此通過γ-CD包埋提高其溶解度和生物利用率，使其成為一種抗衰老和改善健康的營養(yǎng)品[7]。姜黃素是從姜黃根莖分離的黃色多酚，其表現(xiàn)出治療心血管疾病、糖尿病以及阿爾茨海默病的療效，但姜黃素的口服生物利用度不到1%，而經(jīng)過γ-CD包埋后，其生物利用率達到85%或者更高[8]。目前市場上已有宣稱高生物利用率的姜黃膠囊(curcumin Extrakt 45，德國)。γ-CD的其他應(yīng)用案例如表2所示。

表2 γ-CD的具體應(yīng)用

目前γ-CD主要通過環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGT酶，EC 2.4.1.19)轉(zhuǎn)化淀粉獲得。CGT酶是糖基水解酶(GH)13家族中的重要成員，其中主要產(chǎn)物為γ-CD的CGT酶稱為γ-CGT 酶[16]。γ-CGT酶通過不同的動力學和熱力學機制同時催化4種反應(yīng)，這些反應(yīng)決定了長時間反應(yīng)的總收率和產(chǎn)物特異性。環(huán)化反應(yīng)是γ-CGT酶的特征反應(yīng)，這是其工業(yè)化生產(chǎn)γ-CD的基礎(chǔ)。此外，γ-CGT酶還催化另外3種反應(yīng)：歧化反應(yīng)、耦合反應(yīng)以及較弱的水解反應(yīng)[17]。環(huán)化反應(yīng)機制如圖2所示[18]，γ-CGT酶先裂解結(jié)合在亞位點+1和-1上的殘基之間的α-1，4-糖苷鍵，形成共價中間體。中間體逐漸呈現(xiàn)環(huán)狀構(gòu)象，并與末端4-羥基重新形成α-1，4-糖苷鍵，最終形成γ-CD。

圖2 γ-CGT酶的環(huán)化反應(yīng)機制

γ-CD的應(yīng)用在國內(nèi)外都有相關(guān)的執(zhí)行標準(表3)。我國GB 2760—2014-14中明確表示γ-CD可在食品中作為穩(wěn)定劑、增稠劑使用，且添加量為按需適量使用；美國FDA認定γ-CD為公認安全使用物質(zhì)(generally recognized as safe, GRAS)，可用作穩(wěn)定劑、乳化劑和載體；歐盟則將其認定為普通食品。因此它的安全性也為其應(yīng)用提供了更多可能。

表3 三種CD的食品監(jiān)管狀況

2 酶法規(guī)模化生產(chǎn)γ-CD研究進展

早期，CD通過發(fā)酵方式獲取，產(chǎn)量和純度均受限，無法滿足市場需求，研究者們圍繞其工業(yè)化展開了大量的探索。其中，β-CD因其溶解度低和絡(luò)合溶劑易去除等優(yōu)勢率先實現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)。但γ-CD的制備工藝遇到了重重阻礙，為此，研究者們圍繞淀粉底物預處理、生物酶法轉(zhuǎn)化淀粉液化物及產(chǎn)物精制工藝等γ-CD的核心制備工藝展開了系統(tǒng)性研究(圖3)[1]。

圖3 酶法合成γ-CD的流程及其關(guān)鍵點

2.1 淀粉的預處理

原淀粉底物的糊化預處理可以有效破壞原淀粉顆粒致密結(jié)構(gòu)，使其體積膨脹，崩解，淀粉鏈伸展，進而提高CGT酶的底物可及性和產(chǎn)物得率。然而，隨著淀粉濃度增高，底物黏度顯著增加，反應(yīng)效率降低；同時底物中的支鏈淀粉在轉(zhuǎn)化時，其分支點附近結(jié)構(gòu)無法被CGT酶作用，降低了底物利用率，為此也可以進行脫支預處理；與α-和β-CD相比，組成γ-CD所需要的葡萄糖殘基更多，利用酶法預處理提高支鏈淀粉側(cè)鏈長將有利于CGT酶合成γ-CD。因此淀粉底物與預處理方法的選擇是提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物得率的2個關(guān)鍵點。淀粉預處理主要環(huán)節(jié)以及不同預處理酶的作用機理如圖4所示。

圖4 酶法預處理淀粉及作用機理

2.1.1 淀粉的選擇

生產(chǎn)γ-CD的底物有玉米淀粉、糯玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉、麥芽糊精和β-CD等等，但最常用的還是木薯淀粉、玉米淀粉等成本低廉的原淀粉。曹新志等[19]在對比玉米、木薯、馬鈴薯、蕉藕和甘薯等淀粉底物時，發(fā)現(xiàn)蕉藕淀粉和甘薯淀粉的轉(zhuǎn)化率最高。GOH等[20]分別以玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原、木薯淀粉為底物進行反應(yīng)，結(jié)果表明使用木薯淀粉產(chǎn)生的CD最多，且γ-CD比例最理想。表4中列出了4種常見淀粉利用不同γ-CGT酶進行γ-CD生產(chǎn)的對比分析。結(jié)果表明，淀粉來源不同，其中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例各不相同，各種CGT酶的鏈長特異性也不同，最終CD得率也有所差異。因此選擇合適的淀粉種類，對最終γ-CD得率具有重要影響。

表4 產(chǎn)γ-CD的淀粉來源及其轉(zhuǎn)化率

2.1.2 預處理方法的選擇

目前的預處理方法包括物理法以及酶法兩大類。在物理法中，MIMI等[25]的超聲法處理和GATT等[26]的擠壓法處理都提高了最終CD的得率。MIMI等[25]發(fā)現(xiàn)適度的熱處理與超濾系統(tǒng)結(jié)合起來既能提高CD轉(zhuǎn)化率也能保護膜的性能。而目前工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的是酶法預處理，所使用的酶包括異淀粉酶、普魯蘭酶、4α-GTase、α-淀粉酶或CGT酶等。RENDLEMAN等[27]利用脫支酶預處理淀粉，充分利用淀粉中的支鏈淀粉。WANG等[28]利用異淀粉酶與CGT酶雙酶法反應(yīng)，也是利用異淀粉酶水解了α-1，6-糖苷鍵，提高了淀粉的利用率。LI等[22]利用4α-GTase預處理淀粉，提高了支鏈淀粉側(cè)鏈長度。這幾種酶預處理方法都是通過改善底物結(jié)構(gòu)組成來提高后期CD轉(zhuǎn)化率。而α-淀粉酶或CGT酶預處理的主要目的是降低淀粉底物黏度，提高轉(zhuǎn)化效率和節(jié)約底物攪拌所需能源[29]。其中α-淀粉酶可以在高溫條件下將淀粉糊化液化，但α-淀粉酶的過度液化會造成底物的浪費和產(chǎn)物CD的降解，產(chǎn)生很多不能被CGT酶利用的單糖和低聚合度寡糖，因此需要嚴格控制α-淀粉酶液化過程。而CGT酶在預處理液化淀粉時只會產(chǎn)生極少量的小糖，在預處理淀粉時展現(xiàn)了獨特優(yōu)勢。NORMAN等[30]從嗜熱厭氧菌中分離得到耐90 ℃高溫的β-CGT酶，在沒有鈣離子的存在下能夠預處理液化35%濃度的淀粉漿液，可應(yīng)用于高濃度淀粉預處理及CD生產(chǎn)中。BENAVENT等[31]研究了CGT酶50 ℃下對玉米和馬鈴薯淀粉的作用，以此理解淀粉結(jié)構(gòu)和CD生產(chǎn)之間的關(guān)系，但這種有限的水解對2種淀粉的糊化行為影響很小。目前預處理中所用的CGT酶都是具有高耐熱性的β-CGT酶，應(yīng)用范圍也主要是β-CD的生產(chǎn)，而大多數(shù)的γ-CGT酶都不具有耐熱性，因此發(fā)現(xiàn)一種耐熱型γ-CGT酶或設(shè)計一種新淀粉預處理工藝將中溫γ-CGT酶應(yīng)用于淀粉預處理顯得尤為重要。

2.2 酶法轉(zhuǎn)化淀粉液化物

酶法轉(zhuǎn)化的工藝環(huán)節(jié)是γ-CD生產(chǎn)的核心環(huán)節(jié)，不同種類的CGT酶以及不同的絡(luò)合劑都能對γ-CD的生產(chǎn)造成很大的影響。對于這2個關(guān)鍵因素，研究者們進行了大量研究，期望尋找到最合適的酶與絡(luò)合劑從而得到更高品質(zhì)的γ-CD。絡(luò)合劑法制備γ-CD的過程如圖5所示。

圖5 絡(luò)合劑法制備γ-CD

2.2.1 酶的選擇

酶法生產(chǎn)γ-CD的關(guān)鍵因素之一是酶的選擇，CGT酶特異性轉(zhuǎn)化淀粉生成γ-CD的活力越高，底物利用率也就越高，同時后期分離純化的成本也將降低。如表5所示，4種已知序列的γ-CGT 酶被篩選出來。TAKADA等[32]表征了來源于Bacillusclarkiistrain 7364的γ-CGT酶，該酶可以將13.7%的淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精，環(huán)糊精中γ-CD占比達79%左右。HIRANO等[33]表征了來源于Bacillussp.G-825-6的γ-CGT酶，該酶不在任何條件下生成α-CD，且以10%可溶性淀粉為底物時，γ-CD與β-CD的比值總是大于4.7。鄭丹妮等[23]表征了來源于Bacillussp.FJAT-44876的γ-CGT酶，該酶同樣不生成α-CD并可將22.38%的淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精，且在添加10%(體積分數(shù))的乙醇時γ-CD占比將達到78.2%左右。這些來源的γ-CGT酶都具備工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

表5 已知序列的γ-CGT酶的主要來源及生產(chǎn)條件

目前已發(fā)現(xiàn)的γ-CGT酶存在產(chǎn)物特異性差、溫度穩(wěn)定性差以及pH穩(wěn)定性差等問題，突變某些重要氨基酸殘基是解決這些問題的重要手段。在產(chǎn)物特異性方面，GOH等[20]構(gòu)建了Bacillussp.G1 CGT酶的H43T突變株，將亞位點-3附近的組氨酸突變?yōu)橛兄虃?cè)鏈的蘇氨酸，對大尺寸CD產(chǎn)生明顯偏好，提高了產(chǎn)物中γ-CD的比例。WANG等[35]發(fā)現(xiàn)Bacillusclarkiistrain 7364 Y186 W突變體表現(xiàn)出了明顯高于野生型的產(chǎn)物特異性，γ-CD占比達到了94.6%左右。在熱穩(wěn)定性方面，LI等[36]通過突變重要殘基提高了來源于Paenibacillussp.的CGT酶的比活性和熱穩(wěn)定性，這些重要殘基往往與疏水相互作用和靜電相互作用有關(guān)。

2.2.2 絡(luò)合劑的選擇

20世紀早期，國外研究者就已證實添加適宜的絡(luò)合劑可有利于提高某一類CD的合成[37]，研究表明絡(luò)合劑可與CD形成復合物，這種復合物的形成可阻礙CD產(chǎn)物與 CGT 酶活性位點的結(jié)合從而解除產(chǎn)物抑制作用，使得反應(yīng)向有利于CD生成的方向進行。所以添加特定的絡(luò)合劑可以促使產(chǎn)物向與加入有機溶劑的分子尺寸相匹配的某一種特定CD轉(zhuǎn)化，從而改變α-CD、β-CD和γ-CD比例，增加目的產(chǎn)物得率(表6)。SATO等[38-39]加入四環(huán)和五環(huán)類萜如甘草酸和甜菊苷可以使γ-CD的轉(zhuǎn)化率從15%提升到40%左右。曹新志[3]在研究γ-CD生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)添加適量甘草酸可以提高γ-CD產(chǎn)量，同時還發(fā)現(xiàn)甘草酸能抑制β-CD的生成。SERES等[40]發(fā)現(xiàn)以甲基乙基酮和1-萘酚的1∶1(摩爾比)混合物作為絡(luò)合劑比單獨使用1-萘酚作為絡(luò)合劑更有利于γ-CD的生產(chǎn)。RENDLEMAN等[41]發(fā)現(xiàn)某些碳十二環(huán)狀化合物可以提高γ-CD產(chǎn)量。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有不飽和六元環(huán)和十個碳原子的食品級無毒烴可在生產(chǎn)和分離β和γ-CD中體現(xiàn)優(yōu)勢，例如AMMERAAL[42]利用柑桔皮油中的食品級檸檬烯絡(luò)合劑從CD混合物中沉淀提取了γ-CD。

表6 不同絡(luò)合劑生產(chǎn)γ-CD的比較

2.2.3 絡(luò)合劑的回收

盡管目前工業(yè)中生產(chǎn)CD主要使用絡(luò)合劑法，但仍然存在許多問題，例如絡(luò)合劑的殘留將導致它們在藥品或食品的應(yīng)用受限。因此得到CD復合物后需要利用蒸氣抽提、液液萃取等方式去除絡(luò)合物中的絡(luò)合劑，絡(luò)合劑去除得越徹底，CD純度越高，也越安全，因此絡(luò)合劑的去除方法對γ-CD的生產(chǎn)十分重要。吳敬等[43,45-46]采用水蒸氣共沸蒸餾法回收有機溶劑，通過該方法可以幾乎全部去除絡(luò)合物中環(huán)十二酮。WU等[45]利用大孔吸附樹脂以及酸沉淀法來分離除去反應(yīng)中的甘草酸，2種分離方法結(jié)果并不理想，因此去除絡(luò)合物中甘草酸的工藝有待進一步研究。沉淀物和水懸浮液中檸檬烯油的除去可以通過沸騰、有機溶劑洗滌、蒸氣注入等方式，其中蒸氣抽提法獲得了最佳結(jié)果[42]。

2.2.4 產(chǎn)物的質(zhì)量控制與檢測標準

在生產(chǎn)純化后，需要通過檢測分析對γ-CD進行質(zhì)量控制[4]。目前常用的檢測手段是HPLC分析，通過外標法既可區(qū)分γ-CD和其他CD，也可初步確定γ-CD 產(chǎn)量。但產(chǎn)物中還有可能存在糊精類雜質(zhì)，因此需要進行紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)分析以及MS分析，確保產(chǎn)物與γ-CD標準品的分析圖譜一致。為了確保絡(luò)合劑與CD實現(xiàn)分離，需要進一步進行GC分析，對標產(chǎn)物與絡(luò)合劑標準品來計算殘留量。為符合產(chǎn)品安全制備標準，殘留量應(yīng)低于6 mg/L。表7為德國瓦克公司生產(chǎn)的γ-CD的質(zhì)量指標表。

表7 γ-CD的質(zhì)量指標

3 γ-CD生產(chǎn)中限制性因素分析

國內(nèi)外許多微生物和加工實驗室都進行過γ-CGT 酶發(fā)酵和γ-CD淀粉轉(zhuǎn)化技術(shù)的開發(fā)，但僅有極少數(shù)團隊掌握了γ-CD的生產(chǎn)技術(shù)，同時產(chǎn)量也十分有限，這其中限制γ-CD規(guī)模化生產(chǎn)的三大因素是過高的酶制劑成本、產(chǎn)物的抑制作用以及復雜的純化工藝(圖6)。

圖6 現(xiàn)階段γ-CD生產(chǎn)的限制性因素

3.1 過高的酶制劑成本

具有高環(huán)化活性的CGT酶的規(guī)模化生產(chǎn)是CD生產(chǎn)的基本需求。已經(jīng)報道的多種γ-CGT酶及其突變體的環(huán)化活性相比較目前工業(yè)生產(chǎn)中所用的β-CGT 酶(日本天野酶公司的CGTase “Amano”產(chǎn)品以及丹麥諾維信公司的Toruzyme?產(chǎn)品)的環(huán)化活性仍有較大差距。除此之外還研究了酶在反應(yīng)周期中的重復使用，從而降低總生產(chǎn)成本，其中針對酶固定化方法的研究包括載體、交聯(lián)試劑和固定化酶穩(wěn)定性等方面的研究，但對于γ-CGT酶的高效重復利用方法仍在研究階段。

CGT酶固定化具有許多潛在的優(yōu)勢，如提高酶的熱穩(wěn)定性，實現(xiàn)酶的重復利用和滿足和反應(yīng)介質(zhì)分離及連續(xù)化生產(chǎn)要求。FENELON等[47]分別以天然載體植物海綿以及高分子質(zhì)量葡萄糖聚合物可得然膠作為載體進行了酶固定化實驗，其中可得然膠作為載體固定化后可以進行CD生產(chǎn)，但酶活性有所下降。RAKMAI等[48]將酶固定在混合藻酸鹽-明膠凝膠珠中時，酶具有很高的穩(wěn)定性并且提高了CD產(chǎn)率。ZHANG等[49]在聚乙烯亞胺存在下，成功將酶固定在聚多巴胺-Fe3O4納米顆粒上并保留了酶活。目前酶固定化技術(shù)仍存在不少問題，如酶蛋白轉(zhuǎn)化率較低且反應(yīng)不穩(wěn)定、增加了工業(yè)成本等等，因此固定化酶的工藝仍然有待改進。

3.2 產(chǎn)物的抑制作用

在酶法生產(chǎn)過程中，隨著反應(yīng)體系中CD含量的增加，會出現(xiàn)明顯的產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象，這主要是因為酶與CD產(chǎn)物相結(jié)合，這種結(jié)合既會阻止底物環(huán)化反應(yīng)的進行，也會促進CD發(fā)生偶合反應(yīng)形成直鏈糊精。為了克服生產(chǎn)過程中的產(chǎn)物抑制問題，通常選擇合適的絡(luò)合劑與生成的CD形成絡(luò)合物沉淀，減少CD發(fā)生偶合反應(yīng)的可能性，此外國內(nèi)外學者還研究了超濾系統(tǒng)以及雙水相系統(tǒng)等方法來實現(xiàn)產(chǎn)物與反應(yīng)體系的分離。

超濾系統(tǒng)是解決CD產(chǎn)物抑制的一種重要的工具，通過超濾系統(tǒng)分離CD，剩余未反應(yīng)的部分及CGT酶返回添加底物繼續(xù)反應(yīng)，這能使CGT酶的環(huán)化反應(yīng)穩(wěn)定進行，這將有利于CD的生產(chǎn)[50-51]。FENELON等[47]利用10 kDa 和50 kDa的超濾膜進行分離操作，而實驗中CGT酶分子質(zhì)量約為78 kDa，α-CD、 β-CD和γ-CD的分子質(zhì)量分別為972、1 135和1 297 Da，因此通過超濾系統(tǒng)可以將CD組分與酶組分分離開，達到減弱產(chǎn)物抑制、提高酶利用率并且純化CD的目的。雙液相系統(tǒng)(aqueous two phase system，ATPS)萃取生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種將生物轉(zhuǎn)化和分離純化整合到一個步驟過程中的技術(shù)。馬來西亞的LIN等[52]使用以聚乙二醇/磷酸鉀溶液為兩相的ATPS，評估了來源于蠟狀芽孢桿菌的CGT酶從可溶性淀粉中提取的γ-CD的生物轉(zhuǎn)化。該技術(shù)成功重復循環(huán)了3次，證實了其低成本和安全的優(yōu)勢。此后LIN等[53]繼續(xù)使用環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷/磷酸鉀液體雙相系統(tǒng)同樣成功重復循環(huán)了4次，證明了與傳統(tǒng)方法相比，磷酸鉀液體雙相系統(tǒng)萃取生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種更好的替代技術(shù)。這種技術(shù)通過雙液相系統(tǒng)，可以將產(chǎn)物分離到一相體系中，而酶法轉(zhuǎn)化淀粉則在另一相體系中進行，從而克服產(chǎn)物抑制問題。

3.3 復雜的純化工藝

現(xiàn)有CGT酶生產(chǎn)γ-CD時產(chǎn)物特異性差，通常會伴隨α-CD、β-CD以及微量雜質(zhì)糊精產(chǎn)生，且γ-CD的溶解度相對較高，不容易通過濃縮、結(jié)晶的方法從反應(yīng)液中分離純化出來。因此，國內(nèi)外還研究了許多分離純化技術(shù)以及工藝優(yōu)化條件來達到純化單一CD的目標。

柱分離系統(tǒng)是使產(chǎn)物溶液依次與離子交換樹脂和凝膠色譜柱接觸，將還原糖或CD吸附在柱上，從而將兩者分離。OKADA等[54]提出了一種純化方法，該方法首先將產(chǎn)物溶液通過裝有堿金屬或強酸性陽離子交換樹脂的柱，分離出CD餾分，再濃縮并通過冷卻沉淀的方式去除部分β-CD，最后通過凝膠色譜柱分離得到γ-CD。KORPELA等[55]測試了具有各種附著配體的載體材料，發(fā)現(xiàn)包含極性基團或通過極性官能團連接到基質(zhì)上的多孔親水性配體在柱分離中最有效。γ-CD可以特異性的與包含萘配體(優(yōu)選通過1或8位結(jié)合)的凝膠相互作用，因此先用1,8-萘酸酐衍生化的Biogel P-6色譜柱分離后，再用Dowex RTM柱分離，得到了高純度的γ-CD。目前的許多研究中都可以得到混合的環(huán)糊精溶液，但從混合液中分離γ-CD仍然是一個挑戰(zhàn)。JI等[56]利用環(huán)糊精水解酶(PpCD酶)達到了純化γ-CD的目的，這是因為PpCD酶對α-CD、β-CD的水解速率遠遠高于γ-CD的水解速率。盡管這種方法可能會造成部分γ-CD的損失，但可以提高γ-CD產(chǎn)品品質(zhì)并且符合清潔標簽，因此該法在γ-CD生產(chǎn)中具有很大的潛力。

4 前景與展望

盡管目前對γ-CD的功能特性以及其應(yīng)用研究已取得較大進展，但對其工業(yè)化制備限制性因素的研究較少。首先，反應(yīng)液中目的γ-CD產(chǎn)物的分離純化難題。若采用絡(luò)合劑共沉淀法，需要尋找一種能和γ-CD形成沉淀且后期容易分離和回收再利用的絡(luò)合劑。若采用非絡(luò)合劑法，需要如柱分離系統(tǒng)、超濾系統(tǒng)等價格高昂的特殊分離技術(shù)和裝備。其次，篩選轉(zhuǎn)化效率高、熱穩(wěn)定性好、產(chǎn)物特異性高的γ-CGT酶的難題，有待于酶工程技術(shù)的進一步發(fā)展。最后，高淀粉底物濃度下的γ-CD轉(zhuǎn)化帶來的高黏度難題，需要探索一條新的淀粉預處理工藝。未來，隨著γ-CD 在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，必然會推動γ-CD 生產(chǎn)瓶頸問題的研究，最終實現(xiàn)γ-CD的國產(chǎn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。