固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定蒜皮中六種酚類物質(zhì)

高若容，王鈿烈，黃雪松*

1(暨南大學(xué) 理工學(xué)院，廣東 廣州，510632) 2(廣東新樂食品有限公司，廣東 潮州，515638)

大蒜(AlliumsativumL.)皮(簡稱蒜皮)，是保護(hù)蒜瓣(即蒜米)的干燥外層膜質(zhì)部分。我國是大蒜生產(chǎn)、消費(fèi)、出口大國，尤其是脫水蒜片的出口量保持逐年增加，2017年達(dá)21.27萬t[1]，僅生產(chǎn)這些脫水蒜片就會產(chǎn)生約5萬t廢棄蒜皮。因此，蒜皮資源豐富，亟待開發(fā)升值。

天然多酚不僅能抗氧化[2-6]、抗炎[7-10]、抗衰老[11-13]，還具有降血糖[14-17]、降血脂[18-20]、抗阿爾茨海默癥[21-23]、調(diào)節(jié)脂代謝等功能[24]。已知蒜皮含有反式對香豆酸、反式阿魏酸、愈創(chuàng)木基甘油-β-咖啡酸醚(guaiacylglycerol-β-caffeic acid ether，GCAE)、愈創(chuàng)木基甘油-β-阿魏酸醚(guaiacylglycerol-β-ferulic acid ether，GFAE)、N-反式對香豆酰真蛸胺(N-trans-coumaroyloctopamine，CO)、N-反式阿魏酰真蛸胺(N-trans-feruloyloctopamine，F(xiàn)O)[25]等多酚類化合物(結(jié)構(gòu)式分別見圖1-B～圖1-G)。目前，除已報(bào)道的FO具有抗阿爾茨海默癥、治療非酒精性脂肪性肝炎、抑制黑色素生成等活性外[26-28]，尚未見其他功能的相關(guān)研究，也未見其定量測定的報(bào)道。因此，為充分利用蒜皮或其所含多酚，亟需簡便、快速、準(zhǔn)確測定蒜皮多酚的方法。

本文擬以超聲法提取蒜皮、固相萃取法處理提取液，建立快速、簡便、準(zhǔn)確定量測定蒜皮中的咖啡酸(圖1-A)、GCAE、CO、對香豆酸、GFAE、阿魏酸6種酚類化合物的方法。

A-反式咖啡酸；B-反式對香豆酸、；C-反式阿魏酸；D-GFAE；E-GCAE；F-CO；G-FO

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，RCI Labscan有限公司；甲醇(色譜純)，天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司；乙醇(分析純)，廣東廣式試劑有限公司；咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-反式對香豆酰基去甲辛弗林(色譜純)，四川維克奇生物科技有限公司。

蒜皮(金鄉(xiāng)大蒜外皮)粉末, 山東省金鄉(xiāng)縣大蒜研究所饋贈。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配SPD-M20A紫外檢測器)，島津(廣州)檢測技術(shù)有限公司；ODS-H C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，中譜科技(福州)有限公司；Discovery DPA-6S(500 mg，6 mL) 固相萃取柱，北京康林科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司；AB SCIEX X500R QTOF高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，美國SCIEX公司；超聲波清洗器，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 定性測定方法

采用高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用(high-performance liquid chromatography-quadruple time of flight mass spectrometry，HPLC-QTOF MS)定性測定酚類物質(zhì)的方法，即：在待優(yōu)化的HPLC方法下，分離樣品中各物質(zhì)并獲得相應(yīng)的色譜峰，然后根據(jù)高分辨率質(zhì)譜儀(high resolution mass spectrometer，HRMS)測定未知物質(zhì)的分子質(zhì)量，再對比標(biāo)準(zhǔn)品的相應(yīng)信息對相關(guān)色譜峰物質(zhì)定性；若無標(biāo)準(zhǔn)品則據(jù)生物代謝、參考文獻(xiàn)[25]等信息進(jìn)行定性。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子電離模式，電噴霧離子源，電噴霧氣壓力50 psi，氣簾氣壓力30 psi，輔助加熱氣壓力60 psi，離子源溫度550 ℃。TOF-MS參數(shù)：掃描質(zhì)量數(shù)m/z50～5 000，離子化電壓5 500 V，去簇電壓(80±40) V，累積時(shí)間0.1 s。IDA 參數(shù)：觸發(fā)二級碎裂掃描的離子強(qiáng)度閾值10 cps，動態(tài)背景扣除，質(zhì)荷比誤差范圍50 MDa，最大候選離子數(shù)10。

1.3.2 HPLC梯度洗脫程序的優(yōu)化

根據(jù)參考文獻(xiàn)[29-30]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)5種HPLC梯度洗脫程序(表1)，根據(jù)所獲樣品HPLC圖選擇最佳梯度洗脫程序。

表1 HPLC系列梯度洗脫程序

其他HPLC條件：ODS-H C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動相A：0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；流動相B：乙腈；流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長320 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1) 單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液

分別稱取上述已經(jīng)定性確定的、可以購買到的咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、CO 4種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并分別定容于10 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL 的單標(biāo)溶液。

(2) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

各取2 mL單標(biāo)溶液于10 mL容量瓶中定容，配制成200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，將此溶液連續(xù)稀釋配成質(zhì)量濃度分別為150、100、50、25、10、5、2.5、0.25、 0.025 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品上樣液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為考察線性范圍、檢出限以及定量下限，在色譜條件下，將1.3.3(2)中的一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 樣品的提取

精密稱取蒜皮干粉末20 g，加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，于超聲功率300 W、超聲頻率25 kHz、超聲溫度50 ℃下，提取30 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)提取過程3次，收集所得的上清液即為蒜皮提取液。

取4 mL濃縮后的蒜皮提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用1 mL甲醇復(fù)溶，然后過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，在色譜條件下HPLC直接進(jìn)樣分析。

1.3.6 固相微萃取方法

(1) 活化

將固相萃取小柱(DPA-6S)柱依次用6 mL甲醇、6 mL的水預(yù)先活化。

(2) 萃取方法

取4 mL濃縮后的蒜皮提取液加入到固相萃取小柱中，緩慢壓濾，控制流速為1.0 mL/min，待樣品被完全吸附后，用6 mL水沖洗小柱以除去大部分干擾物質(zhì)，棄去濾液后，用6 mL體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇將多酚類物質(zhì)洗脫下來，收集甲醇濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用1 mL甲醇復(fù)溶，過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜后，在色譜條件下HPLC進(jìn)樣檢測。

1.3.7 加標(biāo)回收率和精密度的測定

準(zhǔn)確量取已知4種酚類化合物含量的蒜皮提取液0.5 mL，稀釋至1.5 mL后，平均分為3等份，分別向每等份中加入2.5、5、10 mg/L 3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品各0.5 mL，混勻后按照1.3.6進(jìn)行處理，每個加標(biāo)水平平行測定5次。

將所測得的峰面積代入1.3.4中4種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程，計(jì)算各多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并由測得量與加入量計(jì)算4種酚類化合物的回收率。

1.3.8 樣品中6種酚類物質(zhì)的定量測定

(1) 咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、CO的定量

對有標(biāo)品咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、CO 4種酚類物質(zhì)，根據(jù)1.3.4所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線對其進(jìn)行定量測定。

(2) GFAE、GCAE的定量

由于無法購買到GCAE、GFAE標(biāo)準(zhǔn)品，無法對其進(jìn)行定量測定。但考慮到酚類物質(zhì)在檢測器下的紫外吸收是由其特征官能團(tuán)苯環(huán)所決定的，且GCAE、GFAE的結(jié)構(gòu)式中GCAE含有2個咖啡酸、GFAE中含有2個阿魏酸，意味著GCAE、GFAE的紫外最大摩爾吸光度應(yīng)該分別是咖啡酸、阿魏酸的2倍，所以，可以以咖啡酸、阿魏酸作為參照，即咖啡酸、以阿魏酸2倍的校正因子和GCAE、GFAE的峰面積對其定量。

1.3.9 重復(fù)性的測定

將1.3.6下的樣品在色譜條件下HPLC連續(xù)進(jìn)樣測定5次，測得的峰面積代入1.3.4所得4種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程，計(jì)算出4種酚類化合物的平均含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviatio，RSD)。

以咖啡酸、阿魏酸作為參照計(jì)算出無標(biāo)品的GCAE、GFAE的平均含量和RSD。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

蒜皮中各組分的HPLC色譜圖以及多組色譜疊加圖由島津的Labsoluton軟件處理生成，回收率、重復(fù)性、誤差、工作曲線，以及相關(guān)表格的數(shù)據(jù)處理，均采用Excel-2016軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-HRMS對6種酚類物質(zhì)的定性分析

HPLC-HRMS測定結(jié)果如表2所示。在保留時(shí)間為10.87 min總離子流(total ion chromatography，TIC)圖中(圖2-A)，MS測定其分子質(zhì)量為180.035 0 Da(圖2-B)，該質(zhì)譜峰的數(shù)據(jù)庫給出的唯一分子式為C9H8O4，綜合考慮生物代謝(即生物代謝中代表該分子式的物質(zhì)只有咖啡酸)，推測該物質(zhì)為咖啡酸。通過比較咖啡酸標(biāo)品TIC圖的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)(圖2-C、圖2-D)，顯示兩者結(jié)果是一致的，即證實(shí)了圖2-A中1為咖啡酸。這是首次在蒜皮中檢測到了咖啡酸。

同樣地，在保留時(shí)間分別為15.92、16.27、19.85 min 時(shí)(表2)，MS測定其分子質(zhì)量分別為299.108 0、 164.040 0、194.051 0 Da，該分子質(zhì)量與參考文獻(xiàn)[25]所述的CO、對香豆酸、阿魏酸的分子質(zhì)量一致，通過比較CO、對香豆酸、阿魏酸標(biāo)品TIC圖的保留時(shí)間，其保留時(shí)間都是一致，證明圖2-A中3、4、6分別為CO、對香豆酸、阿魏酸。

表2 六種酚類化合物HPLC-HRMS測定結(jié)果

保留時(shí)間分別為14.02、17.19 min時(shí)，其質(zhì)譜峰顯示的分子質(zhì)量分別為376.108 5、390.124 2 Da，且所對應(yīng)的分子式與參考文獻(xiàn)[25]所述的GCAE、GFAE分子式一致，即圖2-A中2為GCAE，5為GFAE。

A-樣品；B-樣品中咖啡酸；C-咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品TIC圖；D-咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品MS圖

綜上定性確定了本文擬測定的咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、CO、GCAE、GFAE共6種酚類物質(zhì)。

2.2 蒜皮中酚類物質(zhì)的定量分析

2.2.1 測定條件的優(yōu)化

(1)梯度洗脫程序的確定

如圖3所示，通過降低乙腈濃度，同時(shí)調(diào)整中間時(shí)段的乙腈遞增速率(表1，方法A～方法E)，從而增大樣品中對香豆酸(圖3色譜峰4)、GFAE(圖3色譜峰5)與雜質(zhì)峰之間分離度，并逐步出現(xiàn)GFAE的完整峰形。方法E中，香豆酸與GFAE已完全分離，能夠滿足定量分析的要求，各目標(biāo)組分峰形完整且在23 min內(nèi)能完全出峰。但方法E并不能分離出FO[25]；因此，若要測定FO，還必需重新改善方法。

環(huán)內(nèi)碳碳雙鍵（＞C=CH-）是在888cm-1附近產(chǎn)生的一處較明顯吸收峰，波羅的海和遼寧撫順均有波數(shù)888cm-1的吸收峰[9]，多米尼加和墨西哥、緬甸所產(chǎn)出琥珀在此處的吸收峰均缺失。

4-對香豆酸；5-GFAE； A-方法A；B-方法B; C-方法C；D-方法D；E-方法E

(2)檢測波長的確定

在200～400 nm得到4種酚類標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖，如圖4所示，CO(a)、對香豆酸(b)、咖啡酸(c)、阿魏酸(d)的最大吸收波長分別為294、309、324、321 nm。鑒于各種物質(zhì)在320 nm左右區(qū)域均有吸收峰，且不受流動相中其他物質(zhì)的干擾，因此，選擇320 nm波長測定上述酚類物質(zhì)。

a-CO；b-對香豆酸；c-咖啡酸；d-阿魏酸

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限測定結(jié)果

根據(jù)信噪比為3確定檢出限(limit of detection，LOD)以及信噪比為10確定定量限(limit of quantitation，LOQ)。如表3所示，4種酚類化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，檢出限為0.33～0.66 mg/L，定量限為1.26～2.32 mg/L。

表3 四種酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.2.3 回收率和精密度測定結(jié)果

4種酚類化合物加標(biāo)回收率為82.79%～100.58%， RSD均小于1%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠(表4)。

表4 加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=5)

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表5 六種酚類化合物含量的重復(fù)性測定結(jié)果

2.3 樣品的測定

2.3.1 固相微萃取對測定蒜皮多酚結(jié)果的影響

由圖5可知，未經(jīng)DPA-6S柱固相微萃取的樣品色譜圖(圖5-A)中雜質(zhì)峰很多，目標(biāo)物與雜質(zhì)峰不能很好地分離，且目標(biāo)物含量低。而采用固相萃取柱前處理提取液(圖5-B)，以淋洗去雜、富集的方式除去了大部分干擾物，提高了目標(biāo)組分的含量，從而對目標(biāo)組分的定量更加準(zhǔn)確。

1-咖啡酸；2-GCAE；3-CO；4-對香豆酸；5-GFAE；6-阿魏酸

2.3.2 樣品測定結(jié)果

由表6可知，樣品中6種酚類物質(zhì)的含量大小順序?yàn)椋篏CAE>阿魏酸>GFAE>CO>咖啡酸>對香豆酸。其中，GCAE的含量最高，達(dá)32.89 mg/kg，而對香豆酸的含量最低，達(dá)2.96 mg/kg，6種酚類物質(zhì)總計(jì)為65.37 mg/kg。

表6 蒜皮中6種酚類化合物的含量

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-HRMS法首次確定了蒜皮中含有咖啡酸。通過超聲法提取蒜皮中的酚類化合物，固相萃取法前處理蒜皮多酚提取液，同時(shí)采用梯度洗脫方法建立了高效液相色譜法定量檢測蒜皮中的對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、CO，并以咖啡酸、阿魏酸作為參考估算蒜皮中GCAE、GFAE的含量。在此方法下，6種酚類化合物分離效果良好，方法的精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系均滿足定性定量要求，適用于蒜皮中6種酚類化合物的定量檢測，為蒜皮多酚物質(zhì)提取以及蒜皮在食品、飼料和藥用等領(lǐng)域的應(yīng)用等提供了有效的檢測方法。